Evaluatie van een genotypische test voor detectie van polymorfismen in het integrase gen van verschillende HIV-1 subtypes De Ruddere Annelies

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

1. Situatieschets en probleemstelling Drugresistentie bij HIV Drugresistentie bij HIV Drugs gericht op verschillende targets Drugs gericht op verschillende targets Nieuwe drug: integrase remmer raltegravir (RAL) Nieuwe drug: integrase remmer raltegravir (RAL) => resistentie onderzoek vereist => resistentie onderzoek vereist

Targets in de replicatiecyclus

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

2. Resistentie onderzoek globaal Ontwikkelen protocol voor sequenering integrase gen voor verschillende HIV-1 subtypes Ontwikkelen protocol voor sequenering integrase gen voor verschillende HIV-1 subtypes Sequenering vóór starten RAL therapie Sequenering vóór starten RAL therapie => polymorfismen => polymorfismen Sequenering na starten RAL therapie Sequenering na starten RAL therapie => ontstaan en evolueren van mutaties => ontstaan en evolueren van mutaties Invloed van polymorfismen op ontstaan van resistentie gelinkte mutaties Invloed van polymorfismen op ontstaan van resistentie gelinkte mutaties

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

3. Concrete doelstellingen Protocol voor sequenering evalueren Protocol voor sequenering evalueren Natuurlijke variabiliteit in het integrase gen onderzoeken Natuurlijke variabiliteit in het integrase gen onderzoeken Opsporen van polymorfismen die in literatuur worden geassocieerd met integrase remmer resistentie Opsporen van polymorfismen die in literatuur worden geassocieerd met integrase remmer resistentie

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

4. Protocol sequenering integrase gen Definitie van een goede integrasesequentie Definitie van een goede integrasesequentie Invloed van aantal amplificatiereacties? Invloed van aantal amplificatiereacties? Invloed van subtype? Invloed van subtype? Invloed van virale lading? Invloed van virale lading?

4. Protocol sequenering integrase gen + analyse

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

5.Natuurlijke variabiliteit Sequenties aligneren in BioEdit en vergelijken met subtype B referentie HXB2 Sequenties aligneren in BioEdit en vergelijken met subtype B referentie HXB2

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

6. Resistentie geassocieerde mutaties Sommige mutaties in literatuur reeds geassocieerd met integrase remmer resistentie Sommige mutaties in literatuur reeds geassocieerd met integrase remmer resistentie Sleutelmutaties: Q148H/R/K, N155H (en Y143R) Sleutelmutaties: Q148H/R/K, N155H (en Y143R)

6. Resistentie geassocieerde mutaties Van vele mutaties is de exacte invloed op resistentie nog niet gekend. Van vele mutaties is de exacte invloed op resistentie nog niet gekend. Vetgedrukt: reeds beschreven in de literatuur als Vetgedrukt: reeds beschreven in de literatuur als polymorfisme polymorfisme

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

7. Resultaten: protocol Invloed van aantal amplificatiereacties => altijd nested PCR uitvoeren PCR uitvoeren

7. Resultaten: protocol Invloed van subtype Invloed van subtype Vooral problemen bij subtype C Vooral problemen bij subtype C Opm.: Niet van elk subtype evenveel stalen onderzocht Opm.: Niet van elk subtype evenveel stalen onderzocht

7. Resultaten: protocol Invloed van virale lading: Amplificatie en sequentieanalyse mogelijk bij virale lading < 1000 viruskopijen per ml.

7. Resultaten: polymorfismen 33,7 % (97/288) van de aminozuurposities is polymorf 33,7 % (97/288) van de aminozuurposities is polymorf Opm.: Consensus per subtype i.p.v. HXB2? Opm.: Consensus per subtype i.p.v. HXB2?

7. Resultaten: resistentie geassocieerde mutaties Op 13 posities zijn polymorfismen aanwezig die Op 13 posities zijn polymorfismen aanwezig die geassocieerd zijn met resistentie. geassocieerd zijn met resistentie. Geen sleutelmutaties gedetecteerd (Q148H/R/K, N155H of Y143R) als natuurlijk polymorfisme Geen sleutelmutaties gedetecteerd (Q148H/R/K, N155H of Y143R) als natuurlijk polymorfisme

7. Resultaten: resistentie geassocieerde mutaties

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

8. Conclusie Protocol: - altijd standaard nested PCR Protocol: - altijd standaard nested PCR - verder onderzoek voor subtype C - verder onderzoek voor subtype C - nog meer subtypes onderzoeken - nog meer subtypes onderzoeken Polymorfismen: misschien in de toekomst beter Polymorfismen: misschien in de toekomst beter een consensus gebruiken per subtype als referentie een consensus gebruiken per subtype als referentie Resistentie geassocieerde mutaties: soms reeds aanwezig als polymorfisme, maar nog weinig gekend over de exacte invloed Resistentie geassocieerde mutaties: soms reeds aanwezig als polymorfisme, maar nog weinig gekend over de exacte invloed

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

9. Blik op de toekomst Sequeneringsprotocol voor integrase gen verder Sequeneringsprotocol voor integrase gen verder op punt stellen op punt stellen Patiënten vooraf screenen bij start therapie met Patiënten vooraf screenen bij start therapie met RAL om polymorfismen vast te stellen RAL om polymorfismen vast te stellen Patiënten opvolgen na start therapie om te kijken welke mutaties ontstaan en hoe ze evolueren Patiënten opvolgen na start therapie om te kijken welke mutaties ontstaan en hoe ze evolueren Link tussen polymorfismen en later ontstaan van Link tussen polymorfismen en later ontstaan van mutaties => RAL therapie nuttig of niet mutaties => RAL therapie nuttig of niet Analoog onderzoek voor elvitegravir Analoog onderzoek voor elvitegravir

1. Situatieschets en probleemstelling 2. Resistentie onderzoek globaal 3. Concrete doelstellingen 4. Protocol sequenering integrase gen 5. Natuurlijke variabiliteit 6. Resistentie geassocieerde mutaties 7. Resultaten 8. Conclusie 9. Blik op de toekomst 10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie

Drie stalen genomen 21/02/08: start therapie; geen sleutelmutaties 21/02/08: start therapie; geen sleutelmutaties 08/03/08: ontstaan van Q148R 08/03/08: ontstaan van Q148R 25/04/08: Q148R weer verdwenen, ontstaan van N155H en E92Q. Reden van switch?? 25/04/08: Q148R weer verdwenen, ontstaan van N155H en E92Q. Reden van switch??

10. Voorbeeld van patiënt onder RAL-therapie Invloed van polymorfismen V72I en V201I niet gekend

Dank u voor uw aandacht