LEUKOCYT DIFFERENTIATIE: INDICATIES VOOR MICROSCOPISCHE REVIEW

SYSMEX-XE-2100TM

SYSMEX-XE-2100TM Analyse van PLT en RBC: elektrische impedantiemeting Leukocyten worden behandeld met fluorochroom dat DNA en RNA bindt. Via hydrodynamische focussing worden WBC één voor één in een meetcel aangevoerd, waar lichtverstrooiing onder kleine hoek en onder hoek van 90° wordt gemeten evenals fluorescentie. Op een dotplot onderscheidt men 5 puntenwolken: debris van RBC - lymfo’s - mono’s - neutro’s + baso’s - eos Basofielen worden bepaald na specifieke lysis van de WBC in licht zuur midden, waarbij de basofielen als enige intacte cellen overblijven. Door lichtverstrooiingsmetingen onder kleine hoek en over 90° treft men de baso’s als een duidelijk afgescheiden populatie aan op de dotplot

DIFF-KANAAL

SYSMEX-XE-2100TM Analyse van PLT en RBC: elektrische impedantiemeting Leukocyten worden behandeld met fluorochroom dat DNA en RNA bindt. Via hydrodynamische focussing worden WBC één voor één in een meetcel aangevoerd, waar lichtverstrooiing onder kleine hoek en onder hoek van 90° wordt gemeten evenals fluorescentie. Op een dotplot onderscheidt men 5 puntenwolken: debris van RBC - lymfo’s - mono’s - neutro’s + baso’s - eos Basofielen worden bepaald na specifieke lysis van de WBC in licht zuur midden, waarbij de basofielen als enige intacte cellen overblijven. Door lichtverstrooiingsmetingen onder kleine hoek en over 90° treft men de baso’s als een duidelijk afgescheiden populatie aan op de dotplot

WBC / BASO- KANAAL

DIFF-KANAAL

IMI-KANAAL

NRBC-KANAAL lysis van RBC en NRBC d.m.v. surfactans geen lysis van WBC fluorochroom kleurt nucleïnezuren in WBC en NRBC meting van lichtverstrooiing en fluorescentie apart scattergram

data management + validation SP-100 smear/stain SP-100 smear/stain XE-2100 XE-2100 result TRANSPORTING BELT request reflex request SIS data management + validation LIS request validated result result …

FLOW-CHART EDTA-bloed SYSMEX XE-2100 validatiecriteria voldaan « data check fail » automatische validatie

VALIDATIECRITERIA Controle op referentie- en alertwaarden IP- flagging (interpretatieve flagging) Validation rules

REFERENTIE- EN ALERTWAARDEN Elk automatisch resultaat wordt getoetst, met uitsluiting van hemato-onco-eenheden ACTIES: - vergelijk met recent voorgaand resultaat indien beschikbaar - één enkele parameter? - logische samenhang tussen correlerende parameters behouden? - alleenstaand feit of niet-patiëntgebonden? - doorbelwaarden overschreden?

IP-FLAGGING Parameters worden door SYSMEX XE-2100 hetzij niet beschikbaar gesteld, hetzij gemerkt als zijnde onbetrouwbaar Op grond van mogelijke morfologische afwijkingen (interpretatie van gecombineerde meetgegevens) Instelling van gevoeligheid van IP-flagging gebaseerd op performantiestudie in labo UZLEUVEN: « minimaal aantal vals positieven zonder pathologie te missen » In UZLEUVEN: RBC-IP-vlaggen niet geactiveerd ACTIES: IP-gevlagde stalen worden automatisch uitgestreken en worden vervolgens microscopisch bekeken

VALIDATIE-RULES 13 supplementaire regels ingesteld in SIS Indien niet voldaan aan deze regels wordt het resultaat weerhouden van autovalidatie Met betrekking tot: - onwaarschijnlijke waarde voor MCV-MCH-MCHC - coherentie Hb & Hct - extreme waarden voor Hb, Hct of RBC - aanwezigheid van koude agglutinines (MCH – MCHC) - interferentie tussen PLT en RBC (MPV - #PLT) - extreme waarden voor WBC of WBC differentiatie - resultaten buiten gevalideerd meetbereik

IS EEN EFFICIËNTERE WORKFLOW MOGELIJK IS EEN EFFICIËNTERE WORKFLOW MOGELIJK? KUNNEN TIJD EN KOSTEN GESPAARD WORDEN? Welke zijn de indicaties voor herhaalde WBC-differentiatie? (interval < 10d) In welke gevallen heeft microscopische review van de door de analyser bekomen (al dan niet gevlagde) resultaten meerwaarde? Is er een plaats voor « smear scanning » i.p.v. manuele « herdiff »? Is het voorschrijven van een minimaal tijdsinterval tussen 2 opeenvolgende manuele differentiaties verantwoord?

1. INDICATIES VOOR HERHAALDE DIFF Follow-up patiënten onder en na chemotherapie Follow-up na stamceltransplantatie Follow-up hematologische maligniteit Follow-up van HIV-patiënten Monitoring van patiënten onder beenmergtoxische therapie Follow-up van inflammatiereacties of infecties

2. REVIEW CRITERIA Geen gouden standaard of guideline, geen concrete literatuurgegevens Voornaamste beslissingsfactor: aard van patiëntenpopulatie / pathologie Pierre et al., 2002: - geen automatisch resultaat beschikbaar - analyser signaleert een mogelijke analytische fout (stolsel, …) - analyser vlag suggereert aanwezigheid van blasten, NRBC, atypische lymfocyten, immature granulocyten of linksverschuiving - laboratoriumspecifieke criteria (referentiewaarden) - klinische criteria (vb. patiënten van bepaalde eenheid)

2. REVIEW CRITERIA Blasts? Immature granulocytes? Atypical Lymphocytes? Abnormal Lymphocytes / lymphoblasts? NRBC? RBC agglutination? RBC lyse resistance Fragments? Platelet clumps? WBC Abnormal scattergram RBC Abnormal scattergram NRBC Abnormal scattergram PLT Abnormal scattergram RET Abnormal scattergram Dimorphic population RBC Abnormal distribution PLT Abnormal distribution WBC < 2000/µl DIFF % RULES

2. REVIEW CRITERIA Blasts? - pertinent: gevoelige flagging noodzakelijk (zelfs 1% mag niet gemist worden) - manuele herdifferentiatie Immature granulocytes? - promyelocyten, myelocyten en metamyelocyten - solitaire flag IMGRAN = 23.8 % van microscopische reviews - zeer subjectieve identificatie: grote inter-observer variabiliteit - manuele differentiatie is aangewezen - Maar, mogelijkheid tot kwantificatie van IG a.h.v. XE-2100 IG Master software

IG-MASTER-MODULE

2. REVIEW CRITERIA Atypical lymphocytes? - geen objectief gedefinieerde celpopulatie (i.t.t. eosinofielen) - geeft aanleiding tot grote inter-observer variabiliteit - belangrijke bias van resultaat (kwantitatief) bij inzage van de reden van flagging  manuele herdifferentiatie waarbij atypische lymfo’s tot de lymfopopulatie worden gerekend met semi-kwantitatieve rapportering Abnormal lymphocytes / lymphoblasts? - gevoelige flagging noodzakelijk - gebrekkige herkenning van lymfoblasten door Sysmex XE-2100 is gekend probleem - manuele herdifferentiatie

2. REVIEW CRITERIA NRBC? - Cave betrouwbaarheid van deze vlag: vals positieven + vals negatieven - mogelijkheid tot kwantificatie op Sysmex XE-2100  reflextesting voor kwantificatie van NRBC op XE-2100 NRBC Abnormal scattergram? - manuele differentiatie is aangewezen ter uitsluiting van NRBC – WBC- interferentie RBC Lyse resistance - Manuele differentiatie is aangewezen,  niet-gelyseerde RBC kunnen interfereren met het WBC scattergram

2. REVIEW CRITERIA RBC agglutination? - geen argumenten voor manuele herdifferentiatie - ongeldige RBC parameters - slide scanning + rapportering « RBC agglutinatie » Fragments? - geen argumenten voor manuele differentiatie, vermits geen interferentie met WBC-scattergram - mogelijkheid tot automatische kwantificatie d.m.v. extra software module - cave betrouwbaarheid van deze vlag - slide scanning: uitsluiten van interferentie met PLT-telling + eventuele rapportering « fragmentocytenexces » - werkpost cytologie beantwoordt gerichte vraag naar « opvolging fragmentocyten »

2. REVIEW CRITERIA PLT clumps? / PLT abn scattergram? / PLT abn distribution? - geen argumenten voor manuele differentiatie, vermits geen interferentie met WBC-scattergram - slide scanning ter uitsluiting van interferentie met RBC-telling + eventuele rapportering « aanwezigheid van trombocytenaggregaten » WBC Abnormal scattergram - manuele differentiatie is aangewezen, vermits celpopulaties mogelijks verkeerd werden geïdentificeerd RET Abnormal scattergram - enkel indien reticulocytentelling werd aangevraagd (zeldzaam) - manuele differentiatie is aangewezen

2. REVIEW CRITERIA Dimorphic population? - geen argumenten voor manuele differentiatie, vermits geen interferentie met WBC-scattergram - belang? andere afwijkingen in RBC-morfologie (traancellen, Howel-jolly bodies, …) worden ook niet gerapporteerd - slide scanning ter uitsluiting van interferentie met PLT-telling RBC abnormal distribution - geen argumenten voor manuele differentiatie, vermits geen interferentie met WBC-scattergram - slide scanning ter uitsluiting van interferentie met PLT-telling

2. REVIEW CRITERIA WBC < 2000/µl ? (solitaire vlag = 4.6 % van reviews) - Wanneer een automatisch resultaat kan worden bekomen, is zeker bij zulke cytose, deze differentiatie de meest precieze, accurate en reproduceerbare. « Automated differential counts are underutilized to assess samples with low leukocyte counts; optimising the use of the automated method should solve many problems » (W. Finn, professor of pathology, Michigan) - Systematisch schrappen van microscopische differentiatie bij stalen onder een bepaalde cytose, gaat ongetwijfeld gepaard met verlies aan waardevolle informatie, zoals « zijn er aberrante cellen aanwezig? » (cfr. Mayo Clinic: no manual differentials on samples with < 500 WBC/µl) - Manuele differentiatie bij zeer lage cytose gebeurt op een dermate klein aantal cellen dat kwantitatieve gegevens misleidend kunnen zijn (statistische imprecisie)

0.48

STATISTISCHE IMPRECISIE RÜMKE, C.L.

STATISTISCHE IMPRECISIE RÜMKE, C.L.

STATISTISCHE IMPRECISIE RÜMKE, C.L.

2. REVIEW CRITERIA WBC < 2000/µl ? - uitvoeren van een buffy coat bij zeer lage cytose zou de workload en TAT aanzienlijk verhogen; bovendien bestaan er geen referentie- waarden voor zulk een staalmanipulatie. - Semi-kwantitatieve rapportering kan een aanvaardbaar alternatief zijn bij lage cytose DIFF % - Neu% < 10, Neu% > 95; Lymf% < 5, Lymf% > 70; Mono% > 20; EO% > 20; Baso% > 5 - manuele differentiatie is aangewezen - ook voor hemato-oncologie eenheden dient de toepassing te worden overwogen

3. SMEAR SCANNING Lantis et al., 2003 - bepaalde vlaggen worden bij voorkeur door slide scanning gecheckt: * RBC-parameters * eosinofilie (>1500/µl) * NRBC? * immature granulocyten? (bij leukocytose <15000/µl) * leukocytose (> 50000/µl) - Enkel bij aantreffen van aberrante celpopulaties of discordantie met automatische telling, wordt microscopische diff uitgevoerd. - geen concrete richtlijnen voor uitvoering, rekenen op professionaliteit van laboratoriumtechnoloog. Administratief tijdbesparend. - impact: TAT, rapportering van meer accurate diff (automatische)

3. SMEAR SCANNING Chapman et al., 2003 - meest toegepast in labo’s met hoge review ratio (hematologische centra) - verschillende uitvoeringswijzen mogelijk, geen afspraken omtrent minimaal te bekijken aantal cellen (technologist discretion). university hospital Michigan  »All flagged samples are first manually screened by a technologist to assess the need (or lack of need) to perform a manual count » Massachusetts general hospital “review but not rediff” mode: technologists review the flagged slide well, paying particular attention to the flagged items. If their inspection is in keeping with the automated differential, no manual differential is performed. By doing so, only 25% of the 44% of samples that require review, have to be truely diffed.”

3. SMEAR SCANNING Mayo Clinic « we have looked at scanning and do use it for high neutrophils (>13000/µl), but I am a bit leary about scanning other flags - just wary of missing something important » UZA / UZ GENT slide scanning wordt steeds toegepast voor RBC en PLT vlaggen, niet voor de overige. CONCLUSIE: - geen eenduidig standpunt te destilleren uit de verschillende bronnen - RBC en PLT vlaggen dragen in UZ LEUVEN niet voor 50% bij - review ratio in UZ LEUVEN < 44%

4. MINIMUM INTER-DIFF TIJDSINTERVAL Brecher et al., 1980 - dagelijkse diff voor opvolging van absoluut aantal neutrofielen (ANC) kent geen indicaties - in 99% van de gevallen is # WBC een goede weerspiegeling van ANC - voorstel: intiële diff + herhaling na 24 – 48u, vervolgens om de 48 u bepaling van # WBC; enkel bij significante wijziging van # WBC: diff Shapiro et al., 1987 - in niet of mild leukopene patiënten met stabiele leukocytose volstaat nagenoeg altijd één diff per week - bij chemopatiënten of instabiele leukocytose kan dagelijkse diff waardevol zijn, als het klinisch beslissingsproces wordt beïnvloed. Chapman et al., 1997 - delta check ter eliminatie van overbodige reviews (als verschil < 10%) - gehospitaliseerde patient: T = 72u, ambulanten: T = 7d

4. MINIMUM INTER-DIFF TIJDSINTERVAL UZA Interval = 24u Diff wordt automatisch geannuleerd bij T < 24u UZ GENT Geen interval John Hopkins Hospital Non-hematology / oncology patient: T = 24u Hematology / Oncology patient: no restriction Mayo Clinic Only one diff is provided per day, for subsequent samples within the same 24 h: diff is deleted, CBC is reported University Hospital Michigan Currently no restrictions

« De meeste moderne celtellers zijn actueel in staat –binnen enkele minuten- tegelijk met het leukocytenaantal een estimatie te geven van het relatieve aantal granulocyten, eosinofielen, basofielen, lymfocyten en monocytaire of daarop gelijkende cellen. Een solitaire leukocytenbepaling zonder formule hoort dan ook weinig of niet meer gebruikt te worden. »

4. MINIMUM INTER-DIFF TIJDSINTERVAL CONCLUSIE Geen eenduidigheid omwille van zeer uiteenlopende patiëntenpopulaties Taak van het labo: clinici attent maken op probleem van repeat testing Mits grondig overleg met clinici lijkt 24u een aanvaardbaar universeel toepasbaar tijdsinterval

AANTAL UITGEVOERDE ANALYSES

AANTAL UITGEVOERDE DIFFS 409 595 FEBRUARI 2004 616 612 302

AANTAL UITGEVOERDE DIFFS MAART 2004 409 595 616 612 302

GEGEVENS FEB-MAART-APRIL 2004 Bij 64.3 % van WBC-tellingen wordt tevens formule gevraagd Review ratio = 28.4 % 28.7 % van de microscopische reviews gebeurt op stalen van patiënten waarbij in de voorbije 48 u reeds een review gebeurde 9.0 % van de microscopische reviews gebeurt op stalen van patiënten waarbij in de voorbije 24u reeds een review gebeurde

PROCENTUEEL AANDEEL IN TOTAAL # DIFFS MET INTERVAL < 24u FEBRUARI 2004 Eenheid

PROCENTUEEL AANDEEL IN TOTAAL # DIFFS MET INTERVAL < 24u MAART 2004

PROCENTUEEL AANDEEL IN TOTAAL # DIFFS MET INTERVAL <48u FEBRUARI 2004 Eenheid

PROCENTUEEL AANDEEL IN TOTAAL # DIFFS MET INTERVAL <48u MAART 2004

WHAT IS THE COST OF DOING A DIFF? OR WHAT IS THE COST OF NOT DOING ONE? ANALYSE KOST (boordtabellen) NOMENCLATUUR 71 Hemoglobine € 0.58 B40 72 RBC-telling + Hct € 1.16 74 WBC-telling 80 trombocytentelling 86 WBC differentiatie € 1.09 (autom.) B80* € 5.38 (micr.) 83 cytologisch onderzoek PB € 27.86

TO DO … Overleg met clinici (vnl. diensten pediatrie, hematologie en interne geneeskunde ) omtrent desiderata en haalbaarheid van wijzigingen in het huidige review systeem. schrappen van zinloze microscopische herdifferentiaties en vervanging door de voorgestelde acties bij volgende flaggings: - PLT clumps? (5.1 % van de reviews) - Fragments? (1.0 % van de reviews) - RBC and PLT Abnormal Scattergram (0.3 % + <0.1 % van de reviews) - Dimorphic population (uiterst zeldzaam) - RBC Agglutination (<0.1 % van de reviews) Evaluatie van automatische Extended Differential Leukocyte Count op Sysmex XE-2100 m.b.v. extra sofware modules voor immature granulocyten en NRBC

XVII INTERNATIONAL SYMPOSIUM, 13th- 15th may 2004 Abstracts

« up until now , each lab had their own criteria for reviewing and validating their samples. A fairly large disparity existed among labs, from the ones validating almost everything to those that hardly validated anything. A group of internationally renowned hematologists from 6 different countries as well as individuals with expertise in hematology lab met in 2001 with the intent to establish a consensus guide for rules and validation criteria for CBC/ DIFF. The intent was to reduce manual sample reviews without jeopardizing the useful information for the clinician. A preliminary review of the data demonstrates excellent correlation between different hospitals as well as a very low number of false positives and negatives when applying these rules. Once these studies have been completed, they will be published in an international magazine with the purpose of obtaining feedback as well as improving the review systems presently being used by different labs »

Ochard Software News Letter Winter 2004