De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Kom verder. Saxion. Medische Microbiologie Studietaak 1: De prokaryote cel: H4 (Bacteria; archaebacteria niet)

Verwante presentaties


Presentatie over: "Kom verder. Saxion. Medische Microbiologie Studietaak 1: De prokaryote cel: H4 (Bacteria; archaebacteria niet)"— Transcript van de presentatie:

1 Kom verder. Saxion. Medische Microbiologie Studietaak 1: De prokaryote cel: H4 (Bacteria; archaebacteria niet)

2 Kom verder. Saxion. Wat is medische microbiologie? KLASSIEK: Patiënt  arts  lichamelijk onderzoek  klinische diagnose Monster-afname –Juiste monster (bloed, urine, pus, faeces, liquor) –Juiste afname, labeling, transport/opslag Microscopisch onderzoek –gekleurd/ongekleurd (bijv. Gram-preparaat) Kweek en reinkweek –op voedingsbodems –in voedingsmedia –identificatie m.b.v. biochemische en/of serologische testen Gevoeligheid voor antibiotica –Diffusiemethoden, breekpunten/MIC MOLECULAIR: Serologische diagnostiek: meting specifieke antistoffen DNA-technologie

3 Kom verder. Saxion. Prokaryoten Klein, < 2 µm 1 circulair chromosoom Geen kernmembraan Geen histonen Geen organellen Ribosomen 70S Peptidoglycaan- celwand Binaire deling Eukaryoten Groter, 2-20 µm Gepaarde chromosomen Kernmembraan Histonen Organellen Ribosomen 80S (muv mito: 70S) Evt. polysacharide celwand Mitose

4 Kom verder. Saxion. Gemiddelde grootte: 0,2 –1,0 µm  µm Basisvormen: zie boek!

5 Kom verder. Saxion. Bijzondere vormen –Stervormige Stella –Rechthoekige Haloarcula Meeste bacteriesoorten zijn monomorf (één vorm) Sommigen zijn pleomorf (meerdere vormen) Figure 4.5 Geen leerstof

6 Kom verder. Saxion. Paren: diplococci, diplobacilli Clusters: staphylococci Ketens: streptococci, streptobacilli Rangschikkingen

7 Kom verder. Saxion. Celmembraan Celwand Flagellen/fimbriae/pili Kernmateriaal Endporen Een of twee membranen Slijmlaag/kapsel Bouw van bacteriën Figure 4.6a, b

8 Kom verder. Saxion. Voorkomt osmotische lysis Is bij bacteriën gemaakt van peptidoglycaan Celwand Figure 4.6a, b

9 Kom verder. Saxion. Polymeer van een disacharide dat is opgebouwd uit N-acetylglucosamine (NAG) en N-acetylmuraminezuur (NAM) Verbonden door polypeptiden Peptidoglycaan Figure 4.13a

10 Kom verder. Saxion. Dikke peptidoglycaanlaag Teichoïnezuren Mycolinezuur *) Geen LPS G+ celwandG- celwand Dunne peptidoglycaanlaag Geen teichoïnezuren Buitenmembraan LPS (endotoxine) *) : Bij zuurvaste cellen

11 Kom verder. Saxion. Teichoïnezuren: –Lipoteichoïnezuur verbindt met plasmamembraan –Wand-teichoïnezuur verbindt met peptidoglycaan Teichoïnezuren reguleren mogelijk de beweging van kationen Polysachariden zorgen voor antigene variatie Gram-positieve celwanden Figure 4.13b

12 Kom verder. Saxion. Lipopolysachariden (LPS), lipoproteïnen, fosfolipiden Omsluit het periplasma Beschermt tegen fagocyten, complement, antibiotica LPS: –Polysacharide-deel: antigeen; bv. onderscheiding van E. coli O157:H7 –Lipo-deel: lipide A, is een endotoxine Porines (eiwitten) vormen kanalen door de membraan Gram-negatieve buitenmembraan

13 Kom verder. Saxion. Differentiatiekleuringen Onderscheid in bacteriën maken op basis van kleuring (microscoop) Gram-kleuring en Ziehl-Neelsen-kleuring (zuurvaste kleuring) Deze komen uit HOOFDSTUK 3!! (laatste paar pagina’s)

14 Kom verder. Saxion. Er vormen zich kristalviolet-jodium (KV-I) kristallen in het cytoplasma Gram-positieve cel: –Alcohol dehydrateert het peptidoglycaan –KV-I kristallen blijven in de cel Gram-negatieve cel: –Alcohol lost buitenmembraan op en maakt gaten in peptidoglycaan –KV-I wordt weggespoeld Mechanisme Gramkleuring

15 Kom verder. Saxion. Gram Stain Color of Gram + cells Color of Gram – cells Primary stain: Crystal violet Purple Mordant: Iodine Purple Decolorizing agent: Alcohol-acetone PurpleColorless Counterstain: Safranin PurpleRed

16 Kom verder. Saxion. Cellen met mycolinezuur in hun celwand houden kleuring vast bij behandeling met zure alcohol: zuurvaste cellen –Mycobacterium tuberculosis, M. leprae, Nocardia, sommige Corynebacteriën Niet-zuurvaste cellen verliezen de kleuring als ze gespoeld worden met zure alcohol en worden meestal tegengekleurd –Geassocieerde flora, ont- stekingscellen Zuurvaste kleuring (Ziehl-Neelsen) Figure 3.11

17 Kom verder. Saxion. Negatieve kleuring bruikbaar voor kapsels Verhitting nodig om endosporen te kunnen kleuren Voor het kleuren van flagellen is een fixatief (mordant) nodig dat ze dik genoeg maakt om ze te kunnen zien Speciale kleuringen Figure 3.12a-c

18 Kom verder. Saxion. Medische Microbiologie Studietaak 1: De groei en het kweken van micro-organismen H6

19 Kom verder. Saxion. Microbiële groei Groei: toename aantal cellen (niet celgrootte!) Benodigdheden/belangrijk: –Minimum, optimum, maximum kweektemperatuur –pH tussen 6,5 en 7,5 (m.u.v. alkalofiel, acidofiel) –Water (in lab: demiwater / milliQ) –Osmotische druk (m.n. bij halofiel, facultatief halofiel) –Koolstof, stikstof, zwavel, fosfor, spoorelementen, groeifactoren

20 Kom verder. Saxion. THE REQUIREMENTS FOR GROWTH PHYSICAL REQUIREMENTS

21 Kom verder. Saxion. TEMPERATURE

22 Kom verder. Saxion. Psychrotrofen: –Groeien tussen 0°C en 20-30°C –Veroorzaken voedselbederf Mesofielen: –Optimum groeitemperatuur 25-40°C –Meest voorkomende type, waaronder de meeste pathogene - en voedselbedervende m.o. –Micro-organismen die zich hebben aangepast aan het leven in een dierlijke gastheer: optimum temperatuur dichtbij die van gastheer –Veel pathogene bacteriën: optimum temperatuur 37°C

23 Kom verder. Saxion. Hyperthermofielen: –Optimum temperatuur boven de 80°C –Archaea –Hete bronnen rond vulkanische activiteit –Meestal zwavel nodig voor metabolisme –Interessant voor de biotechnologie, als bron van hittebestendige enzymen Pyrococcus furiosus Geen leerstof

24 Kom verder. Saxion. pH

25 Kom verder. Saxion. De meeste bacteriën groeien bij neutrale pH (6,5-7,5) Fungi groeien bij zure pH (5-6) Acidofiele bacteriën groeien in zure milieus Kweken van bacteriën in het lab: uitscheiding van zuren (anaeroob katabolisme!) die de groei uiteindelijk gaan remmen  medium bufferen; mogelijke buffers: –In veel media zit pepton of aminozuren (als N-bron en als az- bron); deze bufferen –In veel media zitten fosfaat-zouten (als P-bron); deze bufferen, met name in het neutrale pH-gebied

26 Kom verder. Saxion. OSMOTIC PRESSURE

27 Kom verder. Saxion. Hypertone omgeving: plasmolyse –Conservering voeding via extra suiker of zout –Max. % agar in vaste media (anders te grote osmotische druk) Hypotone omgeving (bv. demiwater): water de cel in, maar celwand behoedt cel meestal tegen lysis Figure 6.4

28 Kom verder. Saxion. Extremofielen Bij de extremofielen die we tot nu toe gezien hebben (temperatuur, zout, zuur) gaat het vaak om Archaebacteriën (Archaea) Geen leerstof

29 Kom verder. Saxion. THE REQUIREMENTS FOR GROWTH CHEMICAL REQUIREMENTS

30 Kom verder. Saxion. Als basis voor alle biomoleculen en als energiebron (covalente bindingen tussen C-atomen) Chemoheterotrofen gebruiken organische stoffen (biomoleculen) als C- en energiebron Autotrofen gebruiken CO 2 als C-bron CARBON (Koolstof)

31 Kom verder. Saxion. Stikstof: Nodig voor alle aminozuren, eiwitten –N-bron: Meeste bacteriën breken eiwitten af Sommige bacteriën gebruiken NH 4 + of NO 3  Enkele bacteriën gebruiken N 2 (stikstoffixatie) Zwavel: nodig voor bepaalde aminozuren, thiamine, biotine –S-bron: Meeste bacteriën breken eiwitten af Sommige bacteriën gebruiken SO 4 2  of H 2 S Fosfor: Nodig voor DNA, RNA, ATP en membranen –P-bron: fosfaat Spore-elementen: kleine hoeveelheden anorganische elementen, meestal enzym-cofactoren NITROGEN, SULFUR, PHOSPHORUS, TRACE ELEMENTS

32 Kom verder. Saxion. OXYGEN

33 Kom verder. Saxion. Zuurstof is essentieel voor het leven op aarde, maar het is in feite een giftig gas Op de oer-aarde was er zeer weinig zuurstof en waarschijnlijk was er zelfs geen leven ontstaan als er (veel) zuurstof aanwezig was geweest Levensvormen met aerobe respiratie hebben zuurstof nodig voor hun katabolisme, waarbij zuurstof wordt omgezet in ……: –Reultaat: veel ATP en neutralisatie van een potentieel giftig gas (win-win situatie! )

34 Kom verder. Saxion. Naamgeving zuurstofbehoefte Obligaat aeroben: –Hebben zuurstof nodig om te leven (aerobe respiratie) –Zonder zuurstof gaan ze dood Facultatief anaeroben: –Gebruiken zuurstof, maar kunnen ook zonder (switchen tussen aerobe respiratie (veel ATP) en fermentatie (weinig ATP)) Obligaat anaeroben: –Gebruiken geen zuurstof en kunnen er meestal ook niet tegen –Meesten: alleen fermentatie (incl. glycolyse) ; bep. soorten in staat tot anaerobe respiratie = respiratie met alternatieve elektronenacceptor

35 Kom verder. Saxion. Obligaat (strikt) aeroob: –Vrijwel alle dieren (op organisme-niveau!), de meeste schimmels, verschillende bacteriën (bv. Pseudomonas aeruginosa, Mycobacterium tuberculosis) Strikt aerobe micro-organismen kennen geen fermentatie Dieren zijn strikt aeroob omdat ze het op organisme-niveau niet lang uithouden zonder zuurstof (te weinig ATP) –Veel ‘oxidatieve stress’ = giftige effect zuurstof, dus goed verdedigingsmechamisme tegen zuurstof nodig (zie later)

36 Kom verder. Saxion. Facultatief anaeroben: –Hebben verdedigingsmechanisme tegen toxisch effect zuurstof –Groeien uiteraard beter met zuurstof dan zonder –Veel bacteriën (bv. Escherichia coli, Bacillus anthracis, Salmonella, bep. Lactobacilli) en veel gisten en bv. ook dierlijke cellen Obligaat (strikt) anaeroben: –Zijn geen zuurstof gewend –Hebben daarom geen verdedigingsmechanisme tegen het toxische effect van zuurstof –Voorbeelden obligaat anaeroben met fermentatie: bep. Lactobacilli en andere darmflora-bacteriën, Clostridium botulinum, Clostridium tetani –Voorbeelden obligaat anaeroben met alternatieve elektronenacceptor (= anaerobe respiratie): methaanproduceerders (‘methanogenen’) in moerassen, spijsverteringsstelsel van herkauwers, anaerobe rioolwaterzuivering

37 Kom verder. Saxion. Giftige vormen van zuurstof Superoxide vrije radicalen: O 2  –In kleine hoeveelheden gevormd tijdens aerobe respiratie, maar ook bij obligaat anaeroben –Zeer toxisch –Alle organismen die groeien in aanwezigheid O 2 maken deze vorm van zuurstof onschadelijk via: Deze formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de ppt (gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie boek voor correcte formule

38 Kom verder. Saxion. Peroxide anion: O 2 2  Bevindt zich in de H 2 O 2 uit de SOD-reactie Giftig, dus: verder verwerkt via een van deze reacties (meestal katalase) : De onderste formule klopt niet, maar hij zit op deze manier in de ppt (gemaakt door de auteur) en ik kan deze niet aanpassen: zie boek voor correcte formule

39 Kom verder. Saxion. Obligaat aeroben en facultatief anaeroben: SOD en katalase/peroxidase ontgiften Obligaat anaeroben: Geen ontgiftende enzymen Aerotolerante anaeroben: Wel SOD, geen katalase/peroxidase Gedeeltelijke ontgifting Microaerofielen: Waarschijnlijk geen ontgiftende enzymen, maar wel zuurstof nodig Zuurstof niet giftig bij lage concentraties

40 Kom verder. Saxion. Kies uit: Aerotolerante anaeroben, facultatief anaeroben, microaerofielen, obligaat aeroben, obligaat anaeroben

41 Kom verder. Saxion. Essentiële verbindingen –Biomoleculen die het organisme zelf niet kan maken –Om welke biomoleculen het precies gaat, is afhankelijk van de betreffende bacteriesoort: veel bacteriën kunnen alle of de meeste biomoleculen zelf maken –Vitamines, aminozuren, purines, pyrimidines ORGANIC GROWTH FACTORS

42 Kom verder. Saxion. THE REQUIREMENTS FOR GROWTH CULTURE MEDIA

43 Kom verder. Saxion. Definities: –(Kweek)medium: Mengsel van voedingsstoffen voor groei van micro-organisme(n) –Steriel: Geen levende m.o. aanwezig –Inoculum: Aan (kweek)medium toegevoegde m.o. –Enten: het toevoegen van het inoculum –Kweek of culture: M.o. in of op een (kweek)medium Meestal van te voren samengesteld door commerciële leveranciers: ‘just add water’ en steriliseren Definities

44 Kom verder. Saxion. Complex polysacharide uit zeewier Gebruikt voor de bereiding van vaste media: voedingsbodems, schuine agars e.d. De meeste m.o. kunnen agar niet verteren Wordt vloeibaar bij 100°C Wordt weer hard bij ~40°C Agar

45 Kom verder. Saxion. Chemisch gedefinieerde media: –Exacte chemische samenstelling is bekend –Lastig te maken en langzame groei: alleen speciale toep. Complexe media Soorten media

46 Kom verder. Saxion. Complexe media Extracten, bv. van gist of vlees (vandaar dat nog vaak de term ‘bouillon’ wordt gebruikt; dateert uit de tijd van Pasteur) en Peptonen –Korte, wateroplosbare peptiden, onstaan uit zure hydrolyse of enzymatische digestie van een eiwitbron (bv. soja, melk, ….) –Meest gebruikt voor het kweken in het lab –Voornaamste ingrediënt zijn eiwitten: energiebron, C-bron, N-bron, S-bron Vitaminen en andere organische groeifactoren meestal via vlees- of gist-extract (= daarnaast ook extra C- en N-bron) –Bij anaeroob kweken MOET ook een suiker (meestal glucose) worden toegevoegd voor de energie!

47 Kom verder. Saxion. Gedefinieerd vs. complex medium Table 6.2 & 6.4

48 Kom verder. Saxion. Vloeibaar: –Reducerende media Bevatten stoffen (thioglycolaat of oxyrase) die een verbinding aangaan met O 2 Vlak van te voren verhitten om gebonden O 2 te verdrijven Voedingsbodems: –Anaerobe vaten: zie volgende dia –Oxyrase/OxyPlate Enzym oxyrase zet O 2 om in H 2 O Enzym in voedingsbodem: hele plaat wordt een anaerobe ‘kamer’: de OxyPlate Geen speciale apparatuur nodig Anaeroob kweken

49 Kom verder. Saxion. Anaeroob vat –Zakje met natriumbicarbonaat en natriumborohydride bevochtigen –Er onstaat H 2 en CO 2 –Palladium combineert H 2 met O 2 (  H 2 O) Figure 6.5

50 Kom verder. Saxion. Bij m.o.’s die niet op of in media groeien: speciale kweektechnieken nodig, zoals –Proefdieren –Celkweek Veel m.o.’s groeien slechts bij 5-15% CO 2 Speciale kweekmethoden Figure 6.6

51 Kom verder. Saxion. Selectieve media: –Gewenste bacteriën groeien wel, ongewenste niet; bv: Bismuthsulfietagar bij S. typhi Briljantgroenagar bij Salmonella spp. Eosinemethyleenblauwagar (EMB) bij E. coli Differentiële media: –Om kolonies van het aan te tonen m.o. te kunnen onderscheiden van kolonies van andere m.o.; bv: Bloedagar: hemolyse door S. pyogenes EMB medium Enterobacter aerogenes en Escherichia coli Selectieve en differentiële media Figure 6.9b, c De voorbeelden zijn nu nog geen leerstof (komt vanzelf later in module)

52 Kom verder. Saxion. Differentiële media Figure 6.9a Staphylococcus aureus op telluriet-glycine medium Om onderscheid te kunnen maken tussen verschillende bacteriën in een mengsel, om zodoende specifieke bacteriën aan te kunnen tonen en te onderscheiden van andere

53 Kom verder. Saxion. Verrijkingskweken In feite selectief medium, maar dan zodanig dat de groei van een bepaald m.o. zodanig wordt bevorderd dat detecteerbare hoeveelheden cellen ontstaan –Voorbeeld (toepassing): verrijking van fenol- afbrekende m.o. in de bodem door te weken met fenol als enige C- en energiebron

54 Kom verder. Saxion. Reinkweken Een reinkweek bevat maar één soort of stam Een kolonie is een populatie van cellen op een voedingsbodem die afkomstig is van één cel of spore of van een groep van aan elkaar vastzittende cellen Een kolonie wordt vaak een kolonievormende eenheid (KVE) of colony-forming unit (CFU) genoemd

55 Kom verder. Saxion. Methode om losliggende kolonies krijgen Figure 6.10a, b

56 Kom verder. Saxion. Meest gebruikte manieren: Diepvries: -50°tot -95°C (meestal in aanwezigheid van glycero als antivries!) Lyofilisering (vriesdrogen): Bevroren (-54° tot -72°C) en gedehydrateerd in een vacuüm Het bewaren van bacteriekweken

57 Kom verder. Saxion. THE GROWTH OF BACTERIAL CULTURES

58 Kom verder. Saxion. Bij bacteriën bijna altijd binaire deling –Synthese celmateriaal –Instulping celmembraan –Splitsing in twee cellen Groei: aantal bacteriën/bacteriemassa –Per volume-eenheid: #cellen/ml, droge stof/ml –Verdubbelingstijd: delingssnelheid (bijv. per uur), toename massa –Generatietijd of verdubbelingstijd Vermeerdering/groei van bacteriën

59 Kom verder. Saxion. Generatietijd Figure 6.12b Berekening aantal cellen Per generatie verdubbeling van het aantal cellen Dus: Aantal cellen = N 0 x 2 aantal generaties Website Tortora: Intetractive Tutorials H6: alle drie!

60 Kom verder. Saxion. Generatietijd Zie appendix D G (generatietijd) = t(tijd, in minuten)/n(aantal generaties) G = generatietijd = tijd die 1 celdeling duurt = t/n t = een bepaald tijdsinterval: aan het begin en aan het eind hiervan wordt het aantal cellen bepaald A o = aantal cellen bij het begin van het tijdsinterval A t = aantal cellen aan het eind van het tijdsinterval Celdeling: A t = A o x 2 n Oplossen voor n: logA t = logA o + log 2 n = logA o + nlog2 nlog2 = logA t – logA o n = logA t - logA o log2 n = logA t - logA o 0,301

61 Kom verder. Saxion. Stel: 100 cellen groeien in 5 uur naar een totaal van cellen: Berekening aantal generaties en generatietijd Aantal generaties n = log( ) – log(100) = 14,3 log2 Generatietijd G: 5 x 60 min. / n = 21 minuten/generatie

62 Kom verder. Saxion. Figure 6.13 Groeicurve exponentiële groei

63 Kom verder. Saxion. Groeifasen Figure 6.14

64 Kom verder. Saxion. Directe methoden –Plate Count methode seriële verdunningen van een sample, uitplaten, incuberen en tellen (platen met KVE’s) –Filtratiemethode (bij lage hoeveelheden bacteriën) hoeveelheid filtreren door membraanfilter, filter op plaat incuberen –Directe telling bacteriemonster in telkamer beoordelen –Meting optische dichtheid turbiditeit (vlg extinctie) evenredig met bacterieconcentratie Indirect methoden –Metabole activiteit –Drooggewicht Meting van bacteriegroei Figure 6.15, top portion

65 Kom verder. Saxion. Kolonies tellen: Monster eerst ‘doorverdunnen’ Directe meting: Plate Counts Figure 6.15, top portion

66 Kom verder. Saxion. Een aantal verdunningen uitplaten Waarom? Plate Counts Figure 6.16

67 Kom verder. Saxion. Na incubatie: tel aantal kolonies op platen met kolonies (CFU/KVE) Plate Counts Figure 6.15

68 Kom verder. Saxion. Bij zeer kleine aantallen, m.n. in watermonsters Filtration Figure 6.17a, b

69 Kom verder. Saxion. Direct Microscopic count Figure 6.19

70 Kom verder. Saxion. Direct Microscopic Count

71 Kom verder. Saxion. Direct Microscopic Count Nadelen: –Beweeglijke bacteriën moeilijk te tellen –Dode cellen niet of nauwelijks te onderscheiden van levende –Vrij hoge celdichtheden nodig om betrouwbaar te kunnen tellen Voordeel: –Snel (geen incubatietijd)

72 Kom verder. Saxion. Troebeling/turbiditeit (= ‘Turbidity’) Indirecte Methoden Figure 620

73 Kom verder. Saxion. Turbiditeit Spectrofotometer Absorptie (A) / extinctie (E) / optische dichtheid (OD) –A / E / OD = -logT; T= transmissie Hoe hoger de OD, hoe meer cellen aanwezig In logaritmische groeifase loopt OD tegen tijd in ongeveer een rechte lijn Wanneer bekend is hoeveel cellen/ml met een bepaalde OD overeenkomen (1 keer uitzoeken en standaardcurve maken), kan men vanuit een gemeten OD het aantal cellen uitrekenen Gevoeligheid: werkt vanaf 10 7 cellen/ml; bij lagere aantallen geen troebeling; bij te hoge OD: verdunnen

74 Kom verder. Saxion. Voorbeeld standaardcurve Bij Escherichia coli loopt deze curve over een groot gebied lineair als je de OD meet bij 600 nm; vuistregel: 1 OD-eenheid bij 600 nm komt overeen met 8 x 10 8 cellen

75 Kom verder. Saxion. THE END


Download ppt "Kom verder. Saxion. Medische Microbiologie Studietaak 1: De prokaryote cel: H4 (Bacteria; archaebacteria niet)"

Verwante presentaties


Ads door Google