De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

 -Glucuronidase (GUS) Het E. coli enzym GUS wordt veel gebruikt als marker voor genexpressie in transgene planten. De GUS activiteit is een maat voor.

Verwante presentaties


Presentatie over: " -Glucuronidase (GUS) Het E. coli enzym GUS wordt veel gebruikt als marker voor genexpressie in transgene planten. De GUS activiteit is een maat voor."— Transcript van de presentatie:

1  -Glucuronidase (GUS) Het E. coli enzym GUS wordt veel gebruikt als marker voor genexpressie in transgene planten. De GUS activiteit is een maat voor de promotoractiviteit. Doel van het experiment kinetische parameters Bepaling van de kinetische parameters van GUS in een plantenextract. specifieke activiteit Deze parameters zijn nodig om de specifieke activiteit van het enzym in de plant vast te stellen.

2 Reactie om GUS activiteit te meten MUG = 4-methylumbelliferyl-β-D-glucuronide MUB = 4-methylumbelliferon GUS

3  -Glucuronidase (GUS) Opdracht en Resultaat •Meet de activiteit van GUS in het plantenextract als functie van de substraatconcentratie. •Dit levert informatie op over de kinetische parameters van GUS (K M en V MAX ). •Bepaal onder gedefinieerde condities (V MAX condities) de afhankelijkheid van de activiteit van de hoeveelheid plantenextract. •Dit levert een specifieke activiteit van GUS op. Een maat voor genexpressie. Omdat de reactiecondities bekend zijn kunnen anderen waar ook ter wereld de activiteit van GUS nameten. Dit is een vereiste voor een wetenschappelijk verantwoord experiment.

4 Wat zijn Michaelis-Menten kinetische parameters? •De meeste enzymen vertonen Michaelis-Menten kinetiek •Hierbij wordt een reversibel enzym-substraat complex gevormd dat vervolgens wordt omgezet in product en vrij enzym.

5  -Glucuronidase(GUS)  -Glucuronidase (GUS) E + S ESE + P k1k1 k2k2 k -1 v = k 2 [ES]

6 Snelheid als functie van [S] V max maximale snelheid als S >> K M Michaelis constante K M Michaelis constante substraat conc. bij v = ½ V max Michaelis-Menten kinetiek

7 Niet-lineare regressie analyse met een set experimentele data waarbij V 0 (initiële snelheid) wordt gemeten als functie van [S] Meest betrouwbare manier voor het bepalen van K M and V MAX Een afwijkend datapunt kan de uitkomst behoorlijk beinvloeden. Metingen worden daarom vaak in triplo uitgevoerd. Kinetische data analyse

8 Hoe meet je de initiële activiteit? •Meet de beginsnelheid bij verschillende substraat concentraties. •Hou het volume van het cuvet en de enzymconcentratie constant.

9 •K M waarden kunnen sterk variëren •K M hangt af van een specifiek substraat en van de reactiecondities (pH, T en ionsterkte) •V max waarden kunnen ook sterk variëren turnovergetal •V max geeft het turnovergetal van een enzym (k cat ) Betekenis van K M V MAX Betekenis van K M en V MAX

10

11 Eenheid van enzymactiviteit = Unit •1 Unit is de hoeveelheid enzym die de omzetting katalyseert van 1  mol substraat per minuut (bij bepaalde pH, T en I) •specifieke activiteit =  mol min -1 mg -1 •turnovergetal •turnovergetal = aantal  mol substraat omgezet per  mol enzym per seconde •eenheid van turnovergetal = s -1

12

13 Data analyse Als de fit goed is dan weet je dat er rond de V MAX geen substraat remming optreedt. •Meet vervolgens onder V MAX condities ([S] = 10 K M ) bij minimaal drie hoeveelheden plantenextract de activiteit. •Zet de activiteit uit tegen de hoeveelheid plantenextract. Als dit een rechte lijn is, dan is de specifieke activiteit binnen het gemeten gebied onafhankelijk van de gebruikte eiwitconcentraties, dus reproduceerbaar voor anderen. Experiment geslaagd!!

14  -Glucuronidase (GUS)

15

16 Hoe bereken je de specifieke activiteit? •Stel dat GUS een activiteit vertoont van 16.9 nM MUB gevormd per 30 secondes per 20 µL extract. •In het cuvet met 1.00 mL inhoud wordt dan 16.9 (nmol/L) x (L) = 16.9 pmol product geproduceerd per 30 secondes. •Het extract is gemaakt door 20 mg blad fijn te wrijven in 100 µL buffer. Per 20 µL extract is dit 20/100 (µL/µL) x 20 (mg) = 4 mg blad geweest. •De specifieke activiteit wordt dan: 16.9 (pmol) x 2 (1/min) / 4 (per mg blad) = 8.5 pmol/min/mg blad.


Download ppt " -Glucuronidase (GUS) Het E. coli enzym GUS wordt veel gebruikt als marker voor genexpressie in transgene planten. De GUS activiteit is een maat voor."

Verwante presentaties


Ads door Google