Electroforese

Hoe weet je dat de digestie gelukt is?????? Door een deel van het reactiemengsel in een agarosegel te electroforeren

Het maken van een agarosegel http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html Een agarose-oplossing wordt in een bepaalde buffer gemaakt. Agarose lost pas op als de oplossing verwarmd is Na afkoelen wordt de vloeistof in een mal gegoten Een kam zorgt ervoor dat er welletjes worden gemaakt Na stollen wordt de gel in een electroforesbak gelegd onder de electroforesebuffer De DNA monsters worden in de welletjes gepipetteerd De gel wordt geelectroforeerd

Agarosegel electroforese (1) Tijdens de electroforese wordt er een bepaald voltage ingesteld tussen de beide polen, waardoor in aanwezigheid van de juiste buffer een stroom gaat lopen. Bij de heersende pH (pH 7.8) is het DNA negatief geladen. De fosfaatgroepen zijn hier verantwoordelijk voor Het DNA migreert dus naar de + pool.

Agarosegel electroforese (2) De scheiding van lineaire DNA fragmenten vindt plaats op grond van de grootte. Kleine fragmenten migreren sneller door de mazen van de agarose dan de grotere fragmenten

Hoe weet je nu dat de electroforese lang genoeg heeft geduurd? Bij deze electroforese zijn de kleurstoffen BFB en XC gebruikt als kleurmarkers. Je wilt zo kort mogelijk electroforeren, maar ook een zo groot mogelijke scheiding, kortom een duidelijk resultaat. DNA in oplossing is kleurloos. Hoe kan je nu zien dat het ver genoeg geelectroforeerd heeft??? Door aan het DNA monster een opbrengbuffer met een kleurstof toe te voegen kan je het electroforeseproces volgen

De functies van de opbrengbuffer (loading buffer). De loading buffer heeft 3 functies: 1: Het bevat éen of meerdere kleurstoffen zodat het DNA monster zichtbaar wordt. 2: Het bevat een zwaarmaker zodat het DNA monster in het welletje zakt 3: De kleurstoffen bewegen dezelfde kant op als het DNA. De voortgang van de electroforese is zodoende zichtbaar. Er zijn 3 kleurstoffen die veel worden gebruikt; Orange G migreert alsof het 10 – 20 bp lang is Broomfenol blauw migreert ongeveer alsof het een DNA fragment is van 300 bp Xylene cyanol migreert alsof het 4000 bp is

In de loading buffer die aan DNA wordt toegevoegd kunnen verschillende zwaarmakers worden gebruikt: 15 % (w/v) Ficoll 400 30 % Glycerol 40 % Sucrose

Hoe wordt het DNA zichtbaar in de agarosegel??? Wanneer ethidium bromide aan een DNA-oplossing wordt toegevoegd “kruipt” het tussen de baseparen. Dit wordt intercalatie genoemd. Wanneer op een EtBR-DNA complex UV straling valt licht het DNA op (fluorescentie) Voorkom dat Ethidium bromide in je eigen DNA terecht komt. Het kan mutaties veroorzaken.

Twee foto’s van agarosegels. Het (lineaire) DNA fragment kan vergeleken worden met een DNA ladder (marker) waarvan de lengtes van de verschillende bandjes bekend zijn.

Enkele voorbeelden van referentie-ladders voor DNA

Het agarose % bepaalt het scheidend vermogen van de gel Wanneer dezelfde DNA ladder in verschillende agarose % wordt geelectroforeerd ziet het resultaat eruit zoals hiernaast afgebeeld. Afhankelijk van het agarose % is er een lineair verband tussen de loopafstand van het DNA fragment en de lengte in bp. Enkele voorbeelden staan hieronder.