Hoofdstuk 7 Radioactieve merkers Algemeen Voorwaarden voor gebruik Selectie van radiotracers Productie Voor- en nadelen van gebruik Isotoopverdunning (IDA) Radio-immuno assay (RIA) en analoge methoden (ELISA)

Algemene beschouwingen 1913 (Von Hevesy) 210Pb als merker voor bodem  plant migratie-studies Merkers verloop van chemische reactie/fysisch proces volgen plaats van chemische verbinding/modificatie aanduiden (bvb. in een specifiek orgaan van een levend wezen) Radioactieve merkers bevatten radionuclide  eenvoudige activiteitsmeting kwalitatieve informatie: bv. toestand van een systeem kwantitatieve informatie: concentratiebepaling

Voorwaarden voor gebruik Hoofdveronderstellingen radioactief bestanddeel gedraagt zich op exact dezelfde wijze als niet-actief bestanddeel geen verstoring van het te bestuderen systeem bvb. door uitgezonden straling, … tracer meestal in kleine hoeveelheden aanwezig Isotoop-effect meestal weinig belangrijk, maar vele uitzonderingen radio-isotoop  massa-verschil t.o.v. stabiel isotoop  soms andere reactiesnelheid Soms ander vibratiegedrag: nfund,A-B hangt af van entropieveranderingen  andere evenwichtskonstanten combinatie van kinetische/entropische/energetische verschillen

Selectie van radiotracers Rekening houden met fysische/chemische compatibiliteit bv. 125I of 131I bij studie van schildklieractiviteit halfwaardetijd (toediening bij mensen) kort genoeg: meetbare activiteit tijdens experiment lang genoeg: minstens even lang als total duur exp. stralingstype: vermijden van storingen (a,b) praktische overwegingen: kostprijs, beschikbaarheid (merker, detector)

Productie van radiotracers natuurlijk voorkomende: 3H, 14C, Th-, U-isotopen artificiële aanmaak in nucleaire reactoren /diverse versnellers (n,g) reacties  b -, g-actieve radionucliden fissieproducten uitgebreide reeks commerciële radionucliden

Voor- en nadelen Voordelen Nadelen verbeteren van de gevoeligheid gebruik van lage merkerconcentraties (toxiciteit) minder dure detectieapparatuur (bv. MS) autoradiografische detectie (bvb. bij gelelectroforese) vervalproces: niet beïnvloed door T, licht, ci, pH Nadelen laboratoria: gepaste uitrusting/toelatingen radioactief afval inbouw soms duur/tijdrovend

Isotoop verdunning (IDA) Principe specifieke activiteit verandert niet tijdens chemische processen Direct IDA gekende hoeveelheid (massa) radiotracer y + onbekende hoeveelheid x (inactief) Na afscheiden, zuiver en wegen:

Isotoop verdunning (IDA) Voorbeeld: onbekende Co oplossing toegevoegd: y = 7,5 mg 60Co in 10 mL, A = 340 cpm na mengen: Co-neerslag via electrodepositie, massa Co: mx+y = 10,3 mg, activiteit: ax+y= 178 cpm Specifieke activiteit van Co: 178 cpm/10,3 mg = 17,3 cpm/mg massa Co+60Co in neerslag: 340 cpm/17,3 cpm/mg = 19,6 mg massa Co in neerslag: 19,6 – 7,5 mg = 12,1 mg

Toepassingen van IDA Kwantitatieve isolatie is moeilijk/onmogelijk bvb. bepaling van I- in halogenide-mengsel 128I als merker toevoegen neerslag van halogeniden: I- (H2SO4, MnO2) oxideren tot I2  I2-damp zuivere I2-damp condenseert op koud oppervlak I- bepaling op basis van massa/activiteit condensaat Kwantitatieve isolatie mogelijk maar tijdrovend bvb. Co in staal (snelle procedure tijdens staalproductie) oplossen van vloeibaar staal in zuur + toevoegen 60Co Electrodepositie  massa/activiteit van Co

Toepassingen van IDA Sporenniveau/grote verliezen tijdens analyse o.a. bij neerslagvorming aan wanden van recipiënten bvb. 10-100 ppm Sr in mineraalkorrels toevoegen van Sr-radioisotoop na oplossen/scheiding maakt kwantitatieve bepaling van al het Sr overbodig Enkel gedeeltelijke analyse mogelijk bvb. bepaling totaal bloedcelvolume patiënt/proefdier injectie met 52Fe (t½ = 8,3 h) of 59Fe (t½ = 44,5 d) na 1 h (evenwichtinstelling): afname 1 mL bloed  Schatting totale Fe-hoeveelheid, totaal bloedcelvolume

Stabiele-isotoop IDA Massaspectrometrische isotoopverhouding oplossing met onbekende hoeveelheid Sr (m) Natuurlijke abundanties: 88Sr: 82.58%, 84Sr: 0.56% toevoegen van 1.0 pg 84Sr + bepaling van de isotoopverhouding Algemeen geval: binair isotoopmengsel AX/BX oorspronkelijk: qA, qB isotoopfracties spike: QA, QB; met massa y

Radio-immuno assay (RIA) Antigenen en antilichamen lichaamsvreemde stoffen: antigenen reactie van immunologisch systeem: anti-lichamen Antilichamen Immunoglobulinen: IgA, IgM, IgD, IgE, IgG (gamma) Y-vormige structuur Specifieke antigen- antilichaam reactie

Merking van antilichamen Inbouw van 125I (g-straler, t½ = 59,4 d) ook 3H, 14C: vloeibare scintillatiemeting inbouw in aromatische ringen van aminozuren Tyrosine Histidine chloramine-T iodinatie Zachte oxidatie van 125I- naar 125I+ Electrofiele additie op aromatische ringen andere methoden

Competitieve RIA Procedure Competitie tussen samenbrengen van (serum)staal + reagentia incubatieperiode (Ag-Al +Ag*-Al binding) afscheiding van de Ag-Al + Ag*-Al complexen activiteitsmeting Competitie tussen te doseren anti-gen: Ag gemerkte equivalent: Ag*

Competitieve RIA Onbekende serum oplossing – te doseren hoeveelheid: CAg toegevoegd: CAg* en CAl (substoichiometrisch) zelfde affiniteit tussen antilichaam en gewone/gemerkte antigenen Verhouding gewone/gemerkte complexen

RIA calibratiecurven Reeks standaardoplossingen (CAg) met identieke hoeveelheid CAg*, CAl toegevoegd substoichiometrische hoeveelheid Al: CAl  [Ag* - Al]+[Ag - Al] [Ag*]+[Ag] = (CAg* – [Ag* - Al]) - (CAg – [Ag - Al])  CAg* – CAg + CAl

RIA calibratiecurven Schema: verband tussen CAg en (B/F)

Linearisatie v/d calibratiecurve (B/F) vs. log CAg Logit transformatie: logit(y) = ln[y/(1 - y)]