Metabolisatiestudie van methyldienolone en methyltrienolone aan de hand van het in vivo chimeer uPA+/+-SCID muismodel en in vitro humane lever microsomen Otis Van Wayenberge Dr. Sc. Leen Lootens DoCoLab – Universiteit Gent, Zwijnaarde Dr. Sc. Griet Vanbillemont Hogeschool West-Vlaanderen, Brugge

Inhoud Inleiding Materiaal en methoden Methyldienolone 3.1 Humane lever microsomen (HLM) 3.2 Muismodel Methyltrienolone 4.1 Humane lever microsomen (HLM) 4.2 Muismodel Besluit Toekomstperspectief

Inleiding Dopingcontrolelaboratorium (DoCoLab) – UGent Hoofd: Prof. Dr. Peter Van Eenoo Uitvoeren dopingcontrole analyses Geaccrediteerd laboratorium WADA Ontwikkeling van methoden Onderzoek Metabolisatie van methyldienolone en methyltrienolone Inleiding – 2 – 3 – 4 – 5 – 6

Inleiding Anabole androgene steroïden (AAS) Methyldienolone en methyltrienolone Afgeleid van testosteron Binding aan androgeenreceptor in cytoplasma ↓Androgene effecten:↑mannelijke kenmerken en agressiviteit ↑Anabole effecten :↑spiermassa en weefselopbouw botten Staan op de Verboden Lijst WADA Inleiding – 2 – 3 – 4 – 5 – 6

Inleiding Methyldienolone en methyltrienolone Exogene AAS Afgeleid van 19-nortestosteron 17α-gemethyleerde AAS Oraal actief Hepatoxiciteit Methyldienolone Methyltrienolone Inleiding – 2 – 3 – 4 – 5 – 6

Inleiding Metabolisatie In de lever Doel: Steroïden inactiveren en excretie bevorderen Fase I metabolisme – Enzymatisch gekatalyseerde reacties Oxidatie – Hydroxylatie Reductie Fase II metabolisme – Conjugatiereacties Glucuronzuur Sulfaatgroep Inleiding – 2 – 3 – 4 – 5 – 6

Inleiding In vivo chimeer uPA+/+-SCID muismodel Chimere muizen met gehumaniseerde lever Transplantatie humane hepatocyten Doel: Humane metabolisatie nabootsen Voordelen Representatie humane in vivo situatie Nadelen Ethisch bezwaar ten opzichte van in vitro Economisch bezwaar Inleiding – 2 – 3 – 4 – 5 – 6

Inleiding In vitro humane lever microsomen Membraanproteïnen met CYP enzymen Ultracentrifugatie van gehomogeniseerd leverweefsel CYP enzymen centrale rol in fase I metabolisme Voordelen Lage kostprijs Eenvoud in gebruik Nadelen Onvolledige representatie humane in vivo situatie Niet kwantitatief Inleiding – 2 – 3 – 4 – 5 – 6

Materiaal en methoden Analyse HLM Batch: Steroïde: Methyldienolone/Methyltrienolone Blanco controle (geen HLM) Negatieve controle (geen steroïde) Positieve controle (methandiënon) Voorbereiding Eppendorftubes NADPH regenererend systeem Aanpassen milieu HLM + 4u incubatie 37°C Stopreactie 400μL supernatans GC-MS Derivatisatie Droogdampen N2 Vloeistof-vloeistof extractie Inwendige standaard LC-MS2 Solvent 1 – Materiaal en methoden – 3 – 4 – 5 – 6

Materiaal en methoden Analyse muismodel 0,5mL muisurine Batch: Excretie-urine: 24u tot 48u na toediening methyldienolone/methyltrienolone Negatief urinestaal: 24u tot 48u voor toediening Systeem blank Toedieningsoplossing 0,5mL muisurine Inwendige standaard Enzymatische hydrolyse Vloeistof-vloeistof extractie GC-MS Derivatisatie Droogdampen N2 LC-MS2 Solvent 1 – Materiaal en methoden – 3 – 4 – 5 – 6

1 – Materiaal en methoden – 3 – 4 – 5 – 6 Detectiemethoden – GC-MS Stationaire fase: HP Ultra 1 capillaire kolom (15m x 0,25μm; 250μm) Dunne vloeistoffilm: dimethylsilicone Mobiele fase: Helium als draaggas (constante flow: 1mL/min) Temperatuurgradiënt Injectievolume: 1μL Full scan massaspectra 1 – Materiaal en methoden – 3 – 4 – 5 – 6

1 – Materiaal en methoden – 3 – 4 – 5 – 6 Detectiemethoden – LC-MS2 Stationaire fase: C-18 kolom (50mm x 2,1μm; 3,5μm) Mobiele fase: HAc 0,1% 1mM NH4Ac in water/methanol (constante flow: 250μL/min) Verdelingsgradiënt Injectievolume: 25μL Precursor ion scan 1 – Materiaal en methoden – 3 – 4 – 5 – 6

1 – 2 – Methyldienolone – 4 – 5 – 6 HLM (20μg/mL) Resultaten GC-MS Steroïde m/z Structuur Methyldienolone (MD) 430 (415- 340- 325) Methyldienolone Metaboliet M1 518 (503- 428- 413) Methyldienolone + OH 1 – 2 – Methyldienolone – 4 – 5 – 6

1 – 2 – Methyldienolone – 4 – 5 – 6 HLM (20μg/mL) Resultaten LC-MS2 Steroïde m/z Structuur Methyldienolone (MD) 287 Methyldienolone Metaboliet M1’ 303 Methyldienolone + OH Metaboliet M2’ Metaboliet M3’ Metaboliet M4’ Metaboliet M5’ 275 ? Metaboliet M6’ 1 – 2 – Methyldienolone – 4 – 5 – 6

1 – 2 – Methyldienolone – 4 – 5 – 6 Muismodel (200μg/muis) Resultaten GC-MS Steroïde m/z Structuur Methyldienolone (MD) 430 (415- 340- 325) Methyldienolone Metaboliet M1 518 (503- 428- 413) Methyldienolone + OH 1 – 2 – Methyldienolone – 4 – 5 – 6

1 – 2 – Methyldienolone – 4 – 5 – 6 Muismodel (200μg/muis) Resultaten LC-MS2 Steroïde m/z Structuur Methyldienolone (MD) 287 Methyldienolone Metaboliet M0’ 303 Methyldienolone + OH Metaboliet M2’ 1 – 2 – Methyldienolone – 4 – 5 – 6

Methyltrienolone HLM (20μg/mL) Resultaten LC-MS2 Steroïde m/z Structuur Methyltrienolone (MT) 285 Methyltrienolone Metaboliet A1 301 Methyltrienolone + OH Metaboliet A2 1 – 2 – 3 – Methyltrienolone – 5 – 6

Methyltrienolone Muismodel (160μg/muis) Resultaten LC-MS2 Steroïde m/z Structuur Methyltrienolone (MT) 285 Methyltrienolone Metaboliet A0 301 Methyltrienolone + OH Metaboliet A2 1 – 2 – 3 – Methyltrienolone – 5 – 6

Besluit Methyldienolone Methyltrienolone 1 – 2 – 3 – 4 – Besluit – 6

1 – 2 – 3 – 4 – 5 – Toekomstperspectief Identificatie: Structuur achterhalen metabolieten Einddoel: methyldienolone en methyltrienolone opnemen in routinescreening ter detectie 1 – 2 – 3 – 4 – 5 – Toekomstperspectief

Dankwoord Stagementor: Dr. Sc. Leen Lootens Stagegever: Prof. Dr. Peter Van Eenoo Promotor: Dr. Sc. Griet Vanbillemont Alle medewerkers van DoCoLab U allen voor uw aandacht

Metabolisatiestudie van methyldienolone en methyltrienolone aan de hand van het in vivo chimeer uPA+/+-SCID muismodel en in vitro humane lever microsomen Otis Van Wayenberge Dr. Sc. Leen Lootens DoCoLab – Universiteit Gent, Zwijnaarde Dr. Sc. Griet Vanbillemont Hogeschool West-Vlaanderen, Brugge