VUmc Basispresentatie René Vos 14, januari 2016

Presentatie over: "VUmc Basispresentatie René Vos 14, januari 2016"— Transcript van de presentatie:

1 VUmc Basispresentatie René Vos 14, januari 2016
Analyse thiopurines René Vos 14, januari 2016

2 VUmc Basispresentatie
Inleiding Monsterstabiliteit Monstervoorbewerking Dervieux vs Lennard Analyse

3 Stabiliteit

4 Stabiliteit Monsters Kamertemperatuur Koelkast Gewassen ery’s - 20°C - 80°C

5 stabiliteit thiopurinemetabolieten in bloedmonsters

6 stabiliteit thiopurinemetabolieten in erytrocyten

7 Stabiliteit (verzending)

8 Stabiliteit (verzending)

9 Stabiliteit (verzending)
Verzendenvelop niet kouder dan 7°en binnen 18 uur weer op kamertemperatuur. Tempexverzenddoos Minimum temperatuur -4°C. en na 18 uur weer op kamertemperatuur. Grote doos Het beste temperatuurprofiel. De monsters gedurende 47 uur koeler dan 8°C.

10 Monstervoorbewerking

11 Monstervoorbewerking
Scheiden erythrocyten (wassen) centrifugeren bij 3000 rpm plasma en leucocyten afpipetteren PBS buffer toevoegen tot oorspronkelijk volume Na mengen nogmaals centrifugeren Bufferlaag afpipetteren Overgebleven ery’s 1:1 verdunnen met PBS buffer Telling erythrocyten Op Klinisch Chemisch Laboratorium

12 Monstervoorbewerking
Erycount rond de 4 x 1012 RBC/L Opslag bij -20°C Analyse binnen 3 dagen

13 Methodes

14 Methodes

15 Dervieux vs Lennard 6-TG

16 Dervieux vs Lennard 6-MMP
VUmc Basispresentatie Dervieux vs Lennard 6-MMP

17 Analyse

18 Analyse (standaarden en QC’s)
Stockoplossingen 6-thioguanine en 6-mercaptopurine 10 mg 6-TG oplossen in 4ml 0,1N NaOH en aanvullen tot 100ml met aqua dest. 10 mg 6-MMP oplossen in 4ml 0,1N NaOH onder ultrasonen, 10ml 1M HCl toevoegen en aanvullen tot 100ml met aqua dest.

19 Analyse (standaarden en QC’s)
Breng 5ml blanco ery’s in een maatkolf van 10ml Voeg stockoplossing 6-TG en 6-MMP toe Vul aan met PBS buffer

20 Analyse (standaarden en QC’s)
Stockoplossingen worden niet bewaard Opslag standaarden en QC’s bij -80 Houdbaarheid 3 maanden

21 Analyse Pipetteer in verschillende cupjes met rondbodem:
250 μL van de standaarden, patiënten materiaal en controles Voeg toe: 20 μL Interne Standaard 6-TG 20 μL DTT oplossing 1,1 mol/L (vers) 45 μL Perchloorzuur 70-72% en vortex direct even Vervolgens: 1,5 minuten vortexen 15 minuten centrifugeren op RPM breng de heldere vloeistof over in een schroefbuis met dop incubeer 60 minuten bij 100° C in het thermoblok Laat afkoelen en breng over in autosampler vials

22 Analyse

23 Analyse Pipetteer in verschillende cupjes met rondbodem:
250 μL van de standaarden, patiënten materiaal en controles Voeg toe: 20 μL Interne Standaard 6-TG 20 μL DTT oplossing 1,1 mol/L (vers) 45 μL Perchloorzuur 70-72% en vortex direct even Vervolgens: 1,5 minuten vortexen 15 minuten centrifugeren op RPM breng de heldere vloeistof over in een schroefbuis met dop incubeer 60 minuten bij 100°C in het thermoblok Laat afkoelen en breng over in autosampler vials

24 Analyse HPLC instellingen
Waters Symmetry C18; 3.9 x 150 mm; 5μm + guard kolom MF: 0,01M ammoniumacetaat pH 5,5 : Acetonitril (95:5) Flow = 1,2 ml/min Temperatuur = 20°

25 Analyse Chromatogram 5-BU 280nm 6-MMP 304nm 6-TG 341nm DTT

26 Vragen