Optimalisatie van het isoleren en in cultuur brengen van osteocyten

Presentatie over: "Optimalisatie van het isoleren en in cultuur brengen van osteocyten"— Transcript van de presentatie:

1 Optimalisatie van het isoleren en in cultuur brengen van osteocyten
Laura Vernieuwe MRB afdeling reumatologie Stagementor: Dr. Stijn Lambrecht Promotor: Griet Vanbillemont

2 Inhoudsopgave 1. Inleiding en probleemstelling 2. Cellen in het bot 3. Methode 4. Resultaten en discussie 5. Besluit en toekomstperspectief

3 1. Inleiding en probleemstelling
Ideaal: In vitro cultuur van osteoblasten, osteocyten en osteoclasten. Osteocyten: Diep gelegen in matrix van het bot Niet of moeilijk te differentiëren uit precursoren  Bestaand protocol optimaliseren voor het isoleren en opkweken van osteocyten uit botjes van muizen.

4 2. Cellen in het bot Osteoblasten Precursor: mesenchymale stamcellen
Kubisch tot cilindrisch Botvorming Leven slechts enkele weken  Osteocyt  Inactieve osteoblast  Apoptose

5 2. Cellen in het bot Osteoclasten
Precursor: hematopoëtische stamcellen Meerdere kernen Botafbraak Samenspel osteoblasten en osteoclasten  remodellering van het bot

6 2. Cellen in het bot

7 2. Cellen in het bot Osteocyten Precursor: mesenchymale stamcellen
Langlevende cellen Liggen in lacunes Cytoplasma uitlopers Functie: Mechanosensorische cellen Handhaven van calcium in bloed

8 2. Cellen in het bot

9 3. methode Dissectie van de muis Verwijderen achterpoten muis
Vel en haren verwijderen 70% ethanol Beenmerg verwijderen Botjes kleiner maken Isoleren van osteocyten  3 verschillende protocols

10 3. Methode Ethanol (15sec.) Ethanol (15sec.) / 1 Collagenase (20min.)
Fractie Protocol 1 Protocol 2 Protocol 3 Ethanol (15sec.) Ethanol (15sec.) / 1 Collagenase (20min.) 2 3 4 EDTA (30min.) 5 EDTA (20min.) Collagenase (30min.) 6 Botjes kleiner maken 7 8 EDTA (1uur) 9

11 3. Methode Ethanol (15sec.) Ethanol (15sec.) / 1 Collagenase (20min.)
Fractie Protocol 1 Protocol 2 Protocol 3 Ethanol (15sec.) Ethanol (15sec.) / 1 Collagenase (20min.) 2 3 4 EDTA (30min.) 5 EDTA (20min.) Collagenase (30min.) 6 Botjes kleiner maken 7 8 EDTA (1uur) 9

12 3. Methode Ethanol (15sec.) Ethanol (15sec.) / 1 Collagenase (20min.)
Fractie Protocol 1 Protocol 2 Protocol 3 Ethanol (15sec.) Ethanol (15sec.) / 1 Collagenase (20min.) 2 3 4 EDTA (30min.) 5 EDTA (20min.) Collagenase (30min.) 6 Botjes kleiner maken 7 8 EDTA (1uur) 9

13 3. Methode Ethanol (15sec.) Ethanol (15sec.) / 1 Collagenase (20min.)
Fractie Protocol 1 Protocol 2 Protocol 3 Ethanol (15sec.) Ethanol (15sec.) / 1 Collagenase (20min.) 2 3 4 EDTA (30min.) 5 EDTA (20min.) Collagenase (30min.) 6 Botjes kleiner maken 7 8 EDTA (1uur) 9

14 3. Methode In cultuur brengen van de cellen
Protocols 1 & 2  6 wellplaat Protocol 3  24 wellplaat FBS coating CO2 incubator Osteocalcine kleuring Kleuren osteoblasten en osteocyten

15 4. Resultaten en discussie
Celopbrengst per fractie voor incubatie Protocols 1 & 3 Protocol 2

16 4. Resultaten en discussie
Celopbrengst per fractie voor incubatie Protocols 1 & 3 Protocol 2

17 4. Resultaten en discussie
Celopbrengst per fractie voor incubatie Protocols 1 & 3 Protocol 2

18 4. Resultaten en discussie
Celopbrengst per fractie voor incubatie Protocols 1 & 3 Protocol 2

19 4. Resultaten en discussie
Totale celopbrengst per protocol

20 5. Resultaten en discussie
Aantal cellen in botfractie na 8 dagen incubatie (protocol 3)

21 5. Resultaten en discussie
Veel fibroblasten

22 5. Resultaten en discussie
Osteocalcine kleuring  protocol 3 botfractie met FBS coating Negatieve controle

23 5. Resultaten en discussie
Osteocalcine kleuring

24 6. Besluit en toekomstperspectief
Niet te lang behandelen met 70% ethanol Botjes kleiner maken FBS coating Gevoelig voor splitsen  Optimalisatie omtrent isolatie, groeiomstandigheden en controle kleuring

25 Optimalisatie van het isoleren en in cultuur brengen van osteocyten
Laura Vernieuwe MRB afdeling reumatologie Stagementor: Dr. Stijn Lambrecht Promotor: Griet Vanbillemont

26

27 3. Methode Dissectie van de muis
Vel met haren verwijderen door knieschijf vast te nemen en aan het vel te trekken Botjes met zacht weefsel weken in steriele PBS Zacht weefsel en periost verwijderen door schrapen met scalpel Verkregen botten 15sec. onderdompelen in 70% ethanol Botten wassen met steriele PBS Epifyse afsnijden en beenmerg verwijderen met steriele PBS door middel van een injectiespuit Botten wassen, snijden in de lengte en kleiner maken in 1 – 2mm stukjes om het oppervlak te vergroten. Stukjes bot overbrengen in een epje

28 3. Methode Osteocalcine kleuring Medium afnemen
Fixeren met 200µL 4% paraformaldehyde (15min. op KT) 200µL 0,1% Triton X-100 (4min. op ijs) 200µL 1% BSA (2h op KT) 200µL primair AL (1h op 37°C) Wassen met 200µL PBS (3x) 200µL secundair AL (30min. op 37°C in het donker) 1 druppel DAPI Afdekken met een draagglaasje Bekijken met een fluorescentiemicroscoop