Optimalisatie van de productie en opzuivering van een recombinant eiwit Daphne Seys Buitenlandse stage gevolgt aan Dublin city university School of biotech
Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie
Onderzoeksvraag Optimalisatie practicum BE 383 Factoren ? Toepasbaar? Eiwitproductie Opzuiveren eiwit van interesse Het optimaliseren van practica labo in module BE383 genetica en celbiologie. Tijdens dit practicum onderzoeken leerlingen de parameters die de productie van een recombinant eiwit in dit geval green fluoresent eiwit met een his-tag beinvloeden en zoeken ze naar de optimale omstandigheden. Vervolgens worden de stalen die ze tijdens de experimenten nemen op een IMAC gelopen ( een kolom voor eiwit opzuivering), Mijn opdracht was om na te gaan of de parameters die in het originele protocol als optimaal worden aangegeven al dan niet moesten aangepast worden, Dit door de verschillende factoren te bepalen die invloed heeft op die productie en opzuivering, Ook werd mij gevraagd om na te gaan of deze optimale omstandigheden wel toepasbaar waren voor het bestaande practicum, Voor mijn experiment heb ik onderscheid gemaakt tussen de parameters die invloed hebben op de productie van het eiwit en deze die invlloed hebben op de opzuivering ervan,
Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie
Dag 1 Dag 2 Materiaal en methodes Overnacht cultuur E.Coli LB Broth + 100 µM Ampicilline (37°C) Dag 2 Inoculeer LB broth 50 µM Ampicilline met 2,5ml o/n cultuur Monitor absorbantie A600 , moet tussen 0,5-0,6 Voeg 200 μl van 50 mM IPTG stock toe Incubeer 3 u bij 37°C neem 1ml staal pellet 18 000 g Resuspendeer in 100 µl lysisbuffer incubeer 30 min. 37°C warmwater bad Centrifugeer op 1500 g neem supernatans SDS-PAGE of IMAC methode Als we een blik werpen op het originele protocol kunnen de parameters er al reeds uitgehaald worden. gastheer, hoeveelheid IPTG, incubatie tijd en temperatuur en de gebruikte techniek om cellen te lyseren,
Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie
Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Oude gastheer vs nieuwe gastheer Variatie in incubatietijd Variatie in concentratie IPTG Variatie temperatuur
Oude gastheer vs nieuwe gastheer zelfde plasmide : PQE-30 en EGFP Andere gastheer: oud : XL-10 gold E.coli nieuw: KRX E.coli PQE-30 plasmide met Egfp ingebracht met BamHI en BglII , Ingebracht via hitte shock techniek: behandeld met Cacl2 op een lage temp hitte shock 42°C Andere gastheer XL-10 : ultra-competent en hoge transformatie efficientie KRK: E. coli K12 derivaat, goed met clonen, engineering en optimaliseerde gecontroleerde eiwit expressie
Resultaten Nemen od omdat het aantal od
Resultaten Gfp heeft een bandjes tussen de27 en 30 kilodaltone
Resultaten Staal absorbantie Concentratie eiwit Oude gastheer 0,218 3,99 mg/ml Nieuwe gastheer 0,259 4,79 mg/ml
Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Oude gastheer vs nieuwe gastheer Variatie in incubatietijd Variatie in concentratie IPTG Variatie temperatuur
Variatie in incubatietijd Invloed groei Stalen op verschillende tijdspunten 74 u Groeicuve van bacterie nagaan (zoeken hoogste punt in log fase juist voor stationaire fase) Optimale groei = optimale eiwite productie
Resultaten
Resultaten
Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Oude gastheer vs nieuwe gastheer Variatie in incubatietijd Variatie in concentratie IPTG Variatie temperatuur
Variatie in concentratie IPTG Invloed eiwit productie Invloed groei Concentratie IPTG: 5 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM en 300 µM Stalen op 0 u, 1 u, 3 u, 5 u, 24 u
Resultaten
Resultaten
Resultaten GFP
Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Oude gastheer vs nieuwe gastheer Variatie in incubatietijd Variatie in concentratie IPTG Variatie temperatuur
Variatie temperatuur Invloed celgroei Stalen op ; 0u , 1u ,3 u, 5 u, 24 u Temperaturen: 4°C, 16°C, 30 °C, 37°C en 60°C
Resultaten
Resultaten
Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Cel lyse Geoptimaliseerd protocol Conclusie
cel lyse Beter cel lyse = meer vrije proteïnen Lyse buffer vs “Commerciele “ Bug buster Oude en nieuwe gastheer Lyse buffer ( lysozyme opgelost in 20 mM Imidazole buffer, Commerciele bugbuster 10x 1x in 100 mM lysis buffer Getest op oude en nieuwe gastheer zien welk effect bug buster had op oude gastheer ( enkel lyszoym methode toegepast in verleden)
IMAC IMAC : immobilized metal affinity chromatograpy, Histidine hecht aan de nkkel in de kolom ( GFP heeft his-tag) Door met wassen met imidazole buffers GFP lost van kolom elueren zuiver GFP ( tussen 100 mM en 200 mM) Ziet duidelijk hoe GFP doorheen de kolom
Resultaten
Resultaten
Resultaten Staal Concentratie eiwit Oude gastheer + lysozyme 2,87 mg/ml Oude gastheer + bug buster 2,98 mg/ml Nieuwe gastheer + lysozyme 3,00 mg/ml Nieuwe gastheer + bug buster 3,33 mg/ml Geen uitsluitsel met kleuring SDS-PAGE standaardcurve BSA via Biuret methode om aantal mg/ml te bepalen Duidelijk verschil tussen oude en nieuwe gastheer maar ook tussen gebruik lysozym methode en bug buster,
Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie
Geoptimaliseerd protocol Dag 1 Overnacht cultuur KRX E.Coli LB Broth + 100 µM Ampicilline (37°C) Dag 2 Inoculeer LB broth 50 µM Ampicilline met 2,5 ml o/n cultuur Monitor absorbantie A600 , moet tussen 0,5-0,6 Voeg 200 μl van 50 mM IPTG stock toe (100 μM IPTG) Incubeer 5 u bij 37°C neem 1 ml staal pellet 18 000g Resuspendeer in 600 µl Bug buster incubeer 20min kamertemp. Centrifugeer op 15 000g neem supernatans SDS-PAGE of IMAC methode
Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie
Geen optimalisatie vereist Conclusie Geen optimalisatie vereist Temperatuur IPTG concentratie Optimalisatie KRX E.coli Incubatietijd 5u Bug buster Suggesties IMAC methode optimaliseren : Meerdere wasbeurten100 mM buffer Andere concentratie was buffers
Bedankt voor uw aandacht Daphne Seys
Optimalisatie van de productie en opzuiveren van een recombinant eiwit Daphne Seys Buitenlandse stage gevolgt aan Dublin city university School of biotech