Daphne Seys Buitenlandse stage gevolgt aan Dublin city university

Slides:



Advertisements
Verwante presentaties
Immunoprecipitatie Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt
Advertisements

Open-Tops in Bergen aan Zee De Fysische Eigenschappen
-Glucuronidase (GUS)
Work shop nieuwe functionaliteit Roy-data Nieuwe bevragings- en procesmogelijkheden release voorjaar 2014 Tjeerd Wierda.
Blackboard Forum Observatieonderzoek 06 februari 2009 Projectgroep 7.
Susceptibiliteitsbepaling van planktonische en sessiele Burkholderia cepacia complex cellen Katrien De Visschere.
3 havo/vwo: een brug naar de tweede fase
Leren redeneren en experimenteren met concept cartoons
Beste PEEP bepaling met behulp van de NICO
Stage klas 3 en 4.
CHEMISCH WEBEXPERIMENT. 2Woudschoten 1 november 2013 Hans van Dijk coordinator Lisette van Rens leerling / leraar materialen ervaringen in de klas Woudschoten.
Chapter 9. Understanding Multivariate Techniques
LENGTE METEN VAN EEN GENOOM
CSE Vaardigheden.
Overzichtsles hoofdstuk 14
Aanpassing planning Volgende week: geen practicum maar Basisstof 3
Alcoholbepalingen Door: Roy Fremouw.
Bouwfysica kouddak-constructie Warmte- en vochtberekening van een
KULeuven: fermentatie van hydrolysaat
Eiwitzuivering 4 Een praktijkvoorbeeld Specifieke en totale activiteit
Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie
Ecologisch functioneren van Nederlandse sloten PLONS Ecologisch functioneren van Nederlandse sloten.
Overzicht scheidingsmethoden
Paragraaf 3.4 Stabiliteit van DNA.
Transport van stoffen Deze les leer je: – de stappen van wetenschappelijk onderzoek opzetten. – hoe transport van stoffen plaatsvindt in een vloeibaar.
Ontwerpen versus onderzoeken
Thema 2 Cellen § 2.4 Opname en afgifte van stoffen tussen cellen en het uit- of inwendig milieu.
Modificerende enzymen
Campylobacter op kipkarkassen uit detailhandel Introductie Campylobacter is een pathogene bacterie die voorkomt op karkassen van verschillende dieren,
Bouwstenen van het leven
Expressie van het DNA De translatie vindt plaats in het cytoplasma.
Vaccinatie tegen Hepatitis B virus ELISA: Primaire en secundaire antistofrespons Edwin Tijhaar.
Inleiding in de biologie
Biologische Labcourse Nanobiologie NB1061 deel 2   Basistechnieken Microscopie, Microbiologie en Moleculaire Biologie Week 9  
Presentatie titel Rotterdam, 00 januari 2007 Cursus Genklonering GKL11 Les3: expressievectoren Rotterdam, september 2010.
Hoofdstuk 4 Transport in cellen
Knutselen met DNA VWO.
De digitale camera toepassing van het foto-elektrisch effect.
Vergelijking van twee commerciële Kleihauer-Betke kleuringen voor bepaling van foetaal bloed Lindsay Vanhuyse Stagementor: Apr. Eline Verhoye Stagebegeleider:
inhoud Situering Inleiding Proefopzet Resultaten en discussie Conclusie.
Voorspellende factoren voor een verandering van gezondheid gerelateerde kwaliteit van leven gedurende 6,7 jaar in vrouwen met overgewicht Achtergrond:
Inleiding Experimenteel Resultaten en discussie Besluit 2.
V ALIDATIE VAN DE AUTOCLAAF SMI 136 X 6 M ETHODEVALIDATIE VAN DE SELECTIVITEIT VAN VITAMINE B1 EN C IN D AVITAMON J UNIOR 1-3 SIROOP Airi Cluyse.
Bepaling van ethanol in biologische monsters met behulp van statische headspace en gaschromatografie met vlamionisatie detector Jan De Rycke.
Plantengroeibevordering door rhizobacteriën
Student: Jana Defever Stageplaats: UZ Gent (ARG) Stagebegeleidster: Cottyn A. Stagegever: Tilleman K. Stagementor: De Roo Chloë Laser capture microdissection.
Student: Sieglinde Pattyn Stagementor: Dr. N. De Wever
Optimalisatie van het maken van paraffineblokjes voor cytologische puncties (type EBUS-EUS) JOKE DAVID 1.
Krachtig ontwerpen op basis van gedegen onderzoek.
Bs.1: onderzoek doen Bs.6: een werkplan maken
Leerwerkplan EM2X Daphne Keller.
Pathologisch Laboratorium - AZ Sint-Lucas te Gent Jolien Pollet
Effect van temperatuursfluctuaties op populatieontwikkeling en co-existentie van cryptische nematodensoorten Titel van mijn bachelorproef: … Stage uitgevoerd.
Metabolisatiestudie van methyldienolone en methyltrienolone aan de hand van het in vivo chimeer uPA+/+-SCID muismodel en in vitro humane lever microsomen.
Hoe wordt HIV-DNA geïntegreerd in het gastheerDNA?
Bachelorproef Academiejaar Cédryck Pauwels FBT
Noel de Kler Martijn Veen
Profiel Product Presentatie
Stoffen transport tussen cellen en hun omgeving.
Herkansingen Fotosynthese Theorie Toepassen
Optimalisatie van het isoleren en in cultuur brengen van osteocyten
Ameline Roose Hogeschool West-Vlaanderen
Populaties Ecologie 7.4.
Leerwerkplan EM2X Daphne Keller.
Plantenfysiologie Fotosynthese 2
Percelen toevoegen Ga naar
Percelen toevoegen Ga naar
Tussenpresentatie.
VUmc Basispresentatie René Vos 14, januari 2016
Transcript van de presentatie:

Optimalisatie van de productie en opzuivering van een recombinant eiwit Daphne Seys Buitenlandse stage gevolgt aan Dublin city university School of biotech

Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie

Onderzoeksvraag Optimalisatie practicum BE 383 Factoren ? Toepasbaar? Eiwitproductie Opzuiveren eiwit van interesse Het optimaliseren van practica labo in module BE383 genetica en celbiologie. Tijdens dit practicum onderzoeken leerlingen de parameters die de productie van een recombinant eiwit in dit geval green fluoresent eiwit met een his-tag beinvloeden en zoeken ze naar de optimale omstandigheden. Vervolgens worden de stalen die ze tijdens de experimenten nemen op een IMAC gelopen ( een kolom voor eiwit opzuivering), Mijn opdracht was om na te gaan of de parameters die in het originele protocol als optimaal worden aangegeven al dan niet moesten aangepast worden, Dit door de verschillende factoren te bepalen die invloed heeft op die productie en opzuivering, Ook werd mij gevraagd om na te gaan of deze optimale omstandigheden wel toepasbaar waren voor het bestaande practicum, Voor mijn experiment heb ik onderscheid gemaakt tussen de parameters die invloed hebben op de productie van het eiwit en deze die invlloed hebben op de opzuivering ervan,

Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie

Dag 1 Dag 2 Materiaal en methodes Overnacht cultuur E.Coli LB Broth + 100 µM Ampicilline (37°C) Dag 2 Inoculeer LB broth 50 µM Ampicilline met 2,5ml o/n cultuur Monitor absorbantie A600 , moet tussen 0,5-0,6 Voeg 200 μl van 50 mM IPTG stock toe Incubeer 3 u bij 37°C neem 1ml staal  pellet 18 000 g Resuspendeer in 100 µl lysisbuffer  incubeer 30 min. 37°C warmwater bad Centrifugeer op 1500 g neem supernatans SDS-PAGE of IMAC methode Als we een blik werpen op het originele protocol kunnen de parameters er al reeds uitgehaald worden. gastheer, hoeveelheid IPTG, incubatie tijd en temperatuur en de gebruikte techniek om cellen te lyseren,

Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie

Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Oude gastheer vs nieuwe gastheer Variatie in incubatietijd Variatie in concentratie IPTG Variatie temperatuur

Oude gastheer vs nieuwe gastheer zelfde plasmide : PQE-30 en EGFP Andere gastheer: oud : XL-10 gold E.coli nieuw: KRX E.coli PQE-30 plasmide met Egfp ingebracht met BamHI en BglII , Ingebracht via hitte shock techniek: behandeld met Cacl2 op een lage temp  hitte shock 42°C Andere gastheer XL-10 : ultra-competent en hoge transformatie efficientie KRK: E. coli K12 derivaat, goed met clonen, engineering en optimaliseerde gecontroleerde eiwit expressie

Resultaten Nemen od omdat het aantal od

Resultaten Gfp heeft een bandjes tussen de27 en 30 kilodaltone

Resultaten Staal absorbantie Concentratie eiwit Oude gastheer 0,218 3,99 mg/ml Nieuwe gastheer 0,259 4,79 mg/ml

Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Oude gastheer vs nieuwe gastheer Variatie in incubatietijd Variatie in concentratie IPTG Variatie temperatuur

Variatie in incubatietijd Invloed groei Stalen op verschillende tijdspunten 74 u Groeicuve van bacterie nagaan (zoeken hoogste punt in log fase juist voor stationaire fase) Optimale groei = optimale eiwite productie

Resultaten

Resultaten

Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Oude gastheer vs nieuwe gastheer Variatie in incubatietijd Variatie in concentratie IPTG Variatie temperatuur

Variatie in concentratie IPTG Invloed eiwit productie Invloed groei Concentratie IPTG: 5 µM, 50 µM, 100 µM, 200 µM en 300 µM Stalen op 0 u, 1 u, 3 u, 5 u, 24 u

Resultaten

Resultaten

Resultaten GFP

Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Oude gastheer vs nieuwe gastheer Variatie in incubatietijd Variatie in concentratie IPTG Variatie temperatuur

Variatie temperatuur Invloed celgroei Stalen op ; 0u , 1u ,3 u, 5 u, 24 u Temperaturen: 4°C, 16°C, 30 °C, 37°C en 60°C

Resultaten

Resultaten

Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Cel lyse Geoptimaliseerd protocol Conclusie

cel lyse Beter cel lyse = meer vrije proteïnen Lyse buffer vs “Commerciele “ Bug buster Oude en nieuwe gastheer Lyse buffer ( lysozyme opgelost in 20 mM Imidazole buffer, Commerciele bugbuster 10x  1x in 100 mM lysis buffer Getest op oude en nieuwe gastheer  zien welk effect bug buster had op oude gastheer ( enkel lyszoym methode toegepast in verleden)

IMAC IMAC : immobilized metal affinity chromatograpy, Histidine hecht aan de nkkel in de kolom ( GFP heeft his-tag) Door met wassen met imidazole buffers  GFP lost van kolom  elueren  zuiver GFP ( tussen 100 mM en 200 mM) Ziet duidelijk hoe GFP doorheen de kolom

Resultaten

Resultaten

Resultaten Staal Concentratie eiwit Oude gastheer + lysozyme 2,87 mg/ml Oude gastheer + bug buster 2,98 mg/ml Nieuwe gastheer + lysozyme 3,00 mg/ml Nieuwe gastheer + bug buster 3,33 mg/ml Geen uitsluitsel met kleuring SDS-PAGE  standaardcurve BSA via Biuret methode om aantal mg/ml te bepalen Duidelijk verschil tussen oude en nieuwe gastheer maar ook tussen gebruik lysozym methode en bug buster,

Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie

Geoptimaliseerd protocol Dag 1 Overnacht cultuur KRX E.Coli LB Broth + 100 µM Ampicilline (37°C) Dag 2 Inoculeer LB broth 50 µM Ampicilline met 2,5 ml o/n cultuur Monitor absorbantie A600 , moet tussen 0,5-0,6 Voeg 200 μl van 50 mM IPTG stock toe (100 μM IPTG) Incubeer 5 u bij 37°C neem 1 ml staal  pellet 18 000g Resuspendeer in 600 µl Bug buster  incubeer 20min kamertemp. Centrifugeer op 15 000g neem supernatans SDS-PAGE of IMAC methode

Inhoud Onderzoeksvraag Materiaal en methoden Resultaten: Optimalisatie eiwit productie Resultaten: Optimalisatie opzuivering Geoptimaliseerd protocol Conclusie

Geen optimalisatie vereist Conclusie Geen optimalisatie vereist Temperatuur IPTG concentratie Optimalisatie KRX E.coli Incubatietijd 5u Bug buster Suggesties IMAC methode optimaliseren : Meerdere wasbeurten100 mM buffer Andere concentratie was buffers

Bedankt voor uw aandacht Daphne Seys

Optimalisatie van de productie en opzuiveren van een recombinant eiwit Daphne Seys Buitenlandse stage gevolgt aan Dublin city university School of biotech