Bepaling van ethanol in biologische monsters met behulp van statische headspace en gaschromatografie met vlamionisatie detector Jan De Rycke

Overzicht Ethanol Statische headspace Optimalisatie Validatie Systeemgeschiktheid Methode Conclusie

Ethanol Legale drug Hersenen zijn het doelwitorgaan Beperkt motorische handelingen en coördinatie Alcohol is de meest gebruikte, legale drug in België. De hersenen zijn het voornaamste doelwitorgaan van alcohol. Alcohol heeft een narcotische werking. Kleine hoeveelheden hebben een invloed op de motorische en psychische reacties. De opname van grotere hoeveelheden alcohol uit zich in symptomen van onderdrukking van bepaalde centra in de hersenen. Deze onderdrukking beperkt onder andere de motorische handelingen en de coördinatie. Bloed wordt bewaard in natriumfluoride tubes met een grijze dop. Hierdoor kan het bloed langer bewaard worden. (RBC verbruikt glucose als energiebron, energieverbruik van RBC wordt stilgezet door NaF  langer bewaren)

Biotransformatie ethanol 5 à 10% onveranderd geëlimineerd via de longen, huid, urine, adem en zweet 90 à 95% wordt via biotransformatie afgebroken tot H2O en CO2 Vijf à tien procent van de alcohol wordt langs verschillende wegen onveranderd geëlimineerd. Dit gebeurt via de longen, de huid ,de urine, de adem en via het zweet. De andere 90 à 95% van de alcohol wordt via biotransformatie afgebroken. Het wordt in het lichaam geoxideerd tot water en CO2. De afbraak van alcohol verloopt in twee stappen. In een eerste stap wordt het ethanol omgezet tot acetaldehyde met behulp van het alcoholdehydrogenase enzym. Dit enzym bevindt zich vooral in het cytoplasma van de lever. Dit acetaldehyde verlaat het lichaam via de longen en is dus verantwoordelijk voor de typische geur van de adem. In een tweede stap wordt dit acetaldehyde enzymatisch omgezet in azijnzuur door aldehydedehydrogenase. Acetaldehyde is een natuurlijk afbraakproduct van ethanol. Het terugvinden van een hoger gehalte acetaldehyde zou dus kunnen wijzen op de omzetting van ethanol tot acetaldehyde. Dit moet vermeden worden aangezien het gehalte ethanol dan lager zou liggen dan het werkelijk is.

Statische Headspace aanwezigheid en concentratiebepaling vluchtige, organische componenten Analyse van verschillende matrices met minimale staalvoorbereiding Statische headspace gaschromatografie is een techniek die gebruikt wordt voor de analyse en de concentratiebepaling van vluchtige, organische componenten. Zonder de headspace zou het tijdrovend zijn om complexe stalen zoals biologische stalen (vb: bloed), farmaceutische producten, plastic en cosmetica te analyseren. Deze matrices bestaan uit verschillende stoffen met verschillend moleculair gewicht, verschillende polariteit en verschillende vluchtigheid. Zonder de headspace zou er een uitgebreide staalvoorbereiding nodig zijn.

Statische Headspace Headspace vial Gas fase (vluchtige componenten) Staal fase (niet-vluchtige componenten) Crimp cap met septum Een headspacestaal wordt gemaakt in een headspace vial. Deze bestaat uit een staal fase en een gas fase. De vluchtige componenten die zich tussen de niet vluchtige componenten van de staal fase bevinden, kunnen geëxtraheerd en vervolgens geïsoleerd worden in de gasfase. Een deel van deze gasfase wordt via een transferline overgebracht naar het gaschromatograaf systeem. Aan het staal wordt ook een zoutoplossing toegevoegd om uit te zouten. Uitzouten is een proces waarbij een anorganisch zout wordt toegevoegd aan een waterige oplossing. Het zout bindt met het water waardoor de oplosbaarheid van de vluchtige componenten afneemt. Hierdoor verloopt de transfer van de vluchtige componenten van de staal fase naar de gas fase beter. De vials worden afgesloten met een crimp cap met septum. Hierdoor kan de gasfase onttrokken worden met behulp van een naald maar kan er niets van gassen ontsnappen.

Gaschromatograaf-FID Kolom: Rtx®-BAC Plus 1 Temperatuur FID: 250 °C Druk: 8 psi Temperatuur injector: 140 °C Split ratio: 10 Run time: 10,5 min Temperatuur (°C) Temperatuurgradiënt (°C/min) Tijd op eenzelfde temperatuur (min) Totaal (min) 40.0 0.0 5.0 150.0 20.0 10.5

Voorbeeld chromatogram

Optimalisatie Platentemperatuur Incubatietijd Uitzouten Volume Het effect van uitzouten Welk zout is het meest geschikt? Volume Het is de bedoeling dat de concentratie van het analiet in de gas fase zo hoog mogelijk is. Dit is afhankelijk van de platentemperatuur, incubatietijd, de aard van het zout en het volume. Er wordt gebruik gemaakt van t-butanol als interne standaard.

Platentemperatuur Om de invloed van de platentemperatuur op de grote van de area of piekoppervlakte te bekijken wordt eenzelfde positief bloedstaal bij verschillende temperaturen geanalyseerd. Het is duidelijk dat de piekoppervlakte groter wordt naarmate de temperatuur stijgt. Maar ook het gehalte acetaldehyde stijgt. Omdat de piek verkregen door acetaldehyde zo laag mogelijk moet blijven wordt er besloten om verder te werken met een platentemperatuur van 50°C.

Procentueel gehalte acetaldehyde Incubatietijd Incubatietijd (min) Area ethanol Area acetaldehyde Procentueel gehalte acetaldehyde 5 164500 3760 2,29% 10 204247 4861 2,38% 15 221793 4782 2,16% 20 222950 4520 2,03% De incubatietijd, of de tijd voordat de gasfase overgaat van de vial naar de kolom, is een belangrijke factor. Het duurt enige tijd voordat het evenwicht tussen staal fase en gas fase bereikt wordt. Als de incubatietijd te kort is, zullen de pieken kleiner zijn omdat het evenwicht nog niet bereikt is. Maar het heeft ook geen nut om de incubatietijd onnodig lang te maken. Eens het evenwicht bereikt is, kan de concentratie analiet in de gas fase niet meer groter worden. Om de incubatietijd te testen wordt eenzelfde positief bloedstaal geanalyseerd met verschillende incubatietijden. De area ethanol stijgt als de incubatietijd langer wordt. Het verschil tussen de piek met incubatietijd 15 minuten en de piek verkregen bij 20 minuten is zeer klein. Het procentueel gehalte acetaldehyde schommelt tussen nauwe grenzen. De run time van de gaschromatograaf is 10 minuten. Na deze 10 minuten moet het systeem 2 minuten afkoelen en stabiliseren. De meest geschikte incubatietijd is 15 minuten, zo worden de grote pieken verkregen en verloopt de overgang tussen 2 stalen zeer vlot.

Procentueel gehalte acetaldehyde Procentueel gehalte acetaldehyde Uitzouten met zout Area ethanol Area acetaldehyde Procentueel gehalte acetaldehyde 1 361132 15403 4,26% 2 363845 15606 4,29% 3 362963 14843 4,09% zonder zout Area ethanol Area acetaldehyde Procentueel gehalte acetaldehyde 1 214885 11247 5,23% 2 223584 11405 5,10% 3 253119 11737 4,64% Om het effect van uitzouten te onderzoeken worden er tweemaal drie identieke stalen gemaakt. Aan 1 reeks stalen wordt er zout toegevoegd en aan de andere reeks niet. Uit de resultaten kan afgeleid worden dat het procentueel gehalte acetaldehyde lager ligt bij de stalen waaraan het zout is toegevoegd. De piekoppervlakte van ethanol is aanzienlijk groter bij de stalen met toegevoegd zout.

Procentueel gehalte acetaldehyde Aard van het zout Zout Area ethanol Area acetaldehyde Procentueel gehalte acetaldehyde K2CO3 246520 2483 1,01% Na2SO4 177253 2808 1,58% MgSO4 149290 2301 1,54% (NH4)2SO4 205010 3581 1,75% blanco 87621 2442 2,79% Er worden vier verschillende 1M zoutoplossingen gemaakt en toegevoegd aan een positief staal. Het zout waarbij de grootste piekoppervlakte ethanol wordt waargenomen is dus het meest geschikt. Kaliumcarbonaat geeft de grootste pieken. ammoniumsulfaat de op een na grootste.

Procentueel gehalte acetaldehyde Aard van het zout Zout Area ethanol Area acetaldehyde Procentueel gehalte acetaldehyde K2CO3 (1) 208254 2590 1,24% K2CO3 (2) 219656 2702 1,23% K2CO3 (3) 232576 2492 1,07% (NH4)2SO4 (1) 181208 4221 2,33% (NH4)2SO4 (2) 177767 3130 1,76% (NH4)2SO4 (3) 191714 3741 1,95% Er wordt een bevestigingstest uitgevoerd om te zien als kaliumcarbonaat meer geschikt is dan ammoniumsulfaat. Er worden tweemaal 3 stalen gemaakt, de ene reeks met toevoeging van kaliumcarbonaat, de andere met ammoniumsulfaat. De stalen met kaliumcarbonaat geven iets grotere pieken en hebben een lager procentueel gehalte acetaldehyde. Maar zorgen voor een groene neerslag en maken de stalen kapot. De stalen met ammoniumsulfaat geven ook goede resultaten en het staal blijft hier wel intact. Ammoniumsulfaat is het meest geschikt en zal gebruikt worden voor verdere analse.

Toegevoegd volume (ml) Procentueel gehalte acetaldehyde Area ethanol Area acetaldehyde Procentueel gehalte acetaldehyde 1,0 371251 3855 1,04% 1,5 301894 3950 1,31% 2,0 235831 3583 1,52% 2,5 192514 3289 1,71% 3,0 166189 2996 1,80% 3,5 136199 2809 2,06% 4,0 124910 2674 2,14% De piekgrootte neemt af naarmate het volume stijgt. Dit is ook te verwachten aangezien het staal meer en meer verdund wordt naarmate het toegevoegd volume toeneemt. Het is veel voordeliger om te werken met 1 ml toegevoegd volume. Er worden grotere pieken verkregen, een lager procentueel gehalte acetaldehyde en de stockoplossing zal langer meegaan.

Optimalisatie Platentemperatuur: 50°C Incubatietijd: 15 minuten Uitzouten: 1M (NH4)2SO4 Volume: 1 mL zoutoplossing + 250 µL staal Interne standaard: t-butanol

Methode validatie Kalibratiemodel R² > 0,9995 Na de optimalisatie volgt de validatie van het systeem en de methode. Er wordt eerst een kalibratiecurve opgesteld met ethanol standaarden. Het is een vijfpunts kalibratie met concentraties 0, 0,5, 1, 2 en 3 g/L. Met behulp van lineaire regressie analyse kan de ethanolconcentratie in de onbekende stalen bepaald worden. Deze curve moet aan een aantal voorwaarden voldoen: de correlatiecoëfficiënt moet groter zijn dan 0,9995 en de controles moeten binnen de toegelaten grenzen vallen.

Kalibratiemodel BIAS en precisie controles Controle (g/L) Ondergrens (g/L) Bovengrens (g/L) Resultaat (g/L) 0,2 0,17 0,23 0,1922 1 0,97 1,03 1,0044 3 2,91 3,09 3,0199 Concentratie (g/L) RUN 1 Resultaat (g/L) RUN 2 RUN3 Resultaat (g/L) RUN 4 Resultaat (g/L) RUN 5 Resultaat (g/L) Laag 0,8 0,7177 0,8068 0,7308 0,6939 0,7675 0,7537 0,7913 0,7520 0,7408 0,7779 0,7473 0,7888 0,7425 0,7545 0,7564 Medium 1,1 1,0261 1,0878 1,0737 1,0658 1,0683 1,0531 1,1022 1,0360 1,0566 1,0502 1,0459 1,0896 1,0673 1,0610 1,0474 Hoog 3 2,9742 2,9427 2,9634 2,9856 3,0859 2,9346 2,9847 2,9994 2,9924 3,0226 2,9352 3,0344 3,0440 3,0209 2,9405 De curve wordt gecontroleerd door drie standaarden te analyseren. De resultaten moeten binnen vastgelegde grenzen vallen. Er wordt een lage (0,2 g/L), een medium (1,0 g/L) en een hoge (3,0 g/L) concentratie gecontroleerd. Als de controles goed zijn kan de curve gebruikt worden voor verdere analyses. Om de bias te bepalen worden er ethanol standaarden in bloed getest. Er wordt opnieuw een lage, medium en hoge concentratie gebruikt. Van elke concentratie worden er gedurende 5 runs drie stalen getest. Met deze resultaten kan de precisie ook berekend worden.

BIAS Within-run precisie Between-run precisie Concentratie (g/L) BIAS 0,8 -5,65 % 1,1 -3,45 % 3,0 -0,31 % Concentratie (g/L) RUN 1 RUN 2 RUN 3 RUN 4 RUN 5 0,8 2,12% 1,00% 1,17% 3,56% 1,14% 1,1 1,10% 0,59% 1,56% 0,35% 0,88% 3,0 0,63% 1,25% 0,51% 1,97% De BIAS is de juistheid van het gemiddelde van verschillende metingen ten opzichte van de werkelijke waarde. Zowel de within-run precisie als de between-run precisie wordt bepaald. De within-run precisie is de precisie van de metingen binnen eenzelfde run. De between-run precisie is de precisie van de metingen van verschillende runs. De bias, within-run en between-run precisie moet kleiner zijn dan 10% De bias en precisie wordt gedefinieerd door de grootste afwijkende waarde. Concentratie (g/L) Between-run precisie 0,8 3,74% 1,1 1,87% 3,0 1,44%

Detectielimiet Bij post mortem stalen wordt het alcoholgehalte niet gerapporteerd indien het lager is dan 0,10 g/L. Gehalten lager dan 0,10 g/L kunnen te wijten zijn aan post mortem rottingsverschijnselen. Bij ante mortem stalen wordt er gerapporteerd vanaf 0,05 g/L, dit wordt ook als cut-off waarde beschouwd. Er wordt eerst nagegaan als er bij lagere concentraties ook nog een signaal wordt waargenomen. Hiervoor wordt een verdunningsreeks aangemaakt. Hiervoor wordt er vertrokken van een 2 g/L standaard. Vervolgens wordt er een 0,05 g/L standaard aangemaakt. Er worden vijf stalen met deze standaard getest om de acuraatheid te bepalen. De relatieve standaarddeviatie, berekend op deze vijf metingen, moet kleiner zijn dan 10% en de metingen mogen niet meer dan 30% afwijken van de werkelijke waarde.

Relatieve standaarddeviatie Detectielimiet Afwijking < 30% en relatieve standaard deviatie < 10% Concentratie (g/L) Resultaat (g/L) 0,2 0,1863 0,1 0,0928 0,05 0,0480 0,025 0,0244 0,0125 0,0118 0,005 0,0054 Resultaat (g/L) Afwijking Gemiddelde (g/L) Standaarddeviatie Relatieve standaarddeviatie 0,0590 18,0% 0,06108 0,00144 2,35% 0,0606 21,2% 0,0612 22,4% 0,0617 23,4% 0,0629 25,8% De detectielimiet is lager dan de cut-off waarde. De afwijking van de 5 stalen van 0,05 g/L is kleiner dan 30% en de relatieve standaarddeviatie is kleiner dan 10%,

Carry-over 6 g/L ethanol Carry-over < 10% laagste kalibrator (0,5 g/L) 105831 10 =10583 Concentratie (g/L) Area ethanol Area ethanol in blanco % ethanol in blanco 0,05 g/L (cut-off) 6 1398808 2314 0,17% 9142 Carry-over is het ongewild terugvinden van een signaal in een staal na de analyse van een positief staal. Om dit te testen wordt er een positief staal met hoge concentratie getest waarna een blanco staal volgt. Het verkregen signaal in het blanco staal mag niet hoger zijn dan 10% van het signaal van de laagste kalibrator. Voor deze test wordt er een 6,0 g/L ethanol oplossing gemaakt. De teruggevonden piekoppervlakte van ethanol in het blanco staal is bijna vier keer zo klein als deze van de detectielimiet. Er wordt slechts 0,17% van een zeer hoge ethanolconcentratie teruggevonden in volgend blanco staal. De carry-over is kleiner dan 10% van het signaal van de laagste kalibrator én de cut-off en vormt dus geen enkel probleem.

Evaluatie van de systeemgeschiktheid Precisie van de injectie Evaluatie van retentietijden van standaarden Kolomoventemperatuur Stabiliteit autosampler

Precisie van de injectie 6 maal interne standaard injecteren Relatieve standaarddeviatie < 15% Area T-butanol Injectie 1 Injectie 2 Injectie 3 Injectie 4 Injectie 5 Injectie 6 152349 149317 158201 150226 159330 157567 Gemiddelde Standaarddeviatie Relatieve standaarddeviatie 154498 4386 2,8% Om de precisie van de injectie te controleren, wordt de interne standaard zes maal geïnjecteerd. De piekoppervlakte wordt gemeten. De relatieve standaarddeviatie berekend op de zes injecties moet kleiner of gelijk aan 15% zijn. De relatieve standaarddeviatie bedraagt 2,8% en is dus kleiner dan 15%.

Relatieve retentietijden Evaluatie van retentietijden van standaarden   Relatieve retentietijden Component Injectie 1 Injectie 2 Injectie 3 Injectie 4 Injectie 5 Injectie 6 Methanol 0,535 0,536 Acetaldehyde 0,566 0,565 Ethanol 0,683 0,682 Isopropanol 0,839 0,840 Aceton 0,914 0,913 T-butanol 1,000 Component Gemiddelde Standaarddeviatie Relatieve standaarddeviatie Methanol 0,535 0,0004 0,08% Acetaldehyde 0,566 0,07% Ethanol 0,683 0,0005 Isopropanol 0,840 Aceton 0,914 0,04% T-butanol 1,000 0,0000 0,00% De Restek Resolution mix (wordt samen met de kolom geleverd) wordt zes maal geïnjecteerd. De relatieve retentietijden van de verschillende componenten worden gemeten. De relatieve standaarddeviatie berekend op de zes injecties van elke component moet kleiner of gelijk zijn dan +/- 0,5%.

Theoretische waarde (°C) Gemiddelde waarde (°C) Kolomoventemperatuur 3 reeksen Gemiddelde berekenen Afwijking werkelijke waarde ten opzichte van theoretische waarde < 5% Tijd (min) Theoretische waarde (°C) Reeks 1 (°C) Reeks 2 (°C) Reeks 3 (°C) Gemiddelde waarde (°C) Afwijking (%) 0,0 40 38,9 39,0 -2,33 Het is belangrijk dat de werkelijke oventemperatuur overeenkomt met de ingestelde temperatuur in het programma. Om dit te controleren, wordt een referentiethermometer in de oven van de GC geplaatst die om de 30 seconden een meting doet. Er worden drie reeksen metingen gedaan van drie opeenvolgende runs. Deze metingen worden achteraf geanalyseerd. De werkelijke temperatuur, geregistreerd door de referentiethermometer mag niet meer dan +/- 5% afwijken van de theoretische temperatuur.

Stabiliteit autosampler 14 identieke positieve bloedstalen Per twee met vier blanco stalen tussen de bloedstalen Maximaal toegelaten verschil is 8% Positie Resultaat (g/L) % verschil 2 1,5076 7% Eerste en laatste meting 3 1,6087 1% 8 1,6251 0% Hoogste en laagste meting 9 1,6130 8% 14   15 1,6166 20 1,5982 2% 21 1,6261 26 1,5755 27 1,5777 32 1,5529 33 1,5651 38 1,5513 39 1,5192 Van eenzelfde bloedstaal worden veertien identieke stalen voorbereid. Deze worden per twee op de carousel van de headspace gezet. Tussen de twee opeenvolgende stalen worden vier blanco stalen geplaatst. Het alcoholgehalte van de achtereenvolgende stalen worden met elkaar vergeleken, alsook het verschil in alcoholgehalte bij de eerste en de laatste meting en de laagste en de hoogste meting.

Conclusie Parameter Vooropgestelde eis Resultaat Precisie van de injectie Relatieve standaarddeviatie ≤15% 2,8% Evaluatie van de relatieve retentietijden Relatieve standaarddeviatie ≤0,5% 0,08% Kolomoventemperatuur   Afwijking ≤ +/- 5% -2,42% Stabiliteit van de autosampler Verschil tussen 2 stalen ≤ 8% 8% Kalibratie model 0 g/L – 3g/L 0 g/L – 3 g/L lineair model Bias ≤ +/- 10% -5,65% Within-run precisie 3,56% Between-run precisie 3,74% Detectielimiet 0,05 g/L < 0,05 g/L Carry-over ≤ 10% signaal laagste kalibrator = 10583 2314 Er is aan alle parameters voldaan, zowel de methode als het systeem voldoet aan de vooropgestelde eisen.

Bepaling van ethanol in biologische monsters met behulp van statische headspace en gaschromatografie met vlamionisatie detector Jan De Rycke