Eiwitzuivering 1 Werken met eiwitten Homogenisatie Detergentia Centrifugatie Zoutprecipitatie Dialyse TBEMH-P05IDB HC5 Sigrid Beiboer en Ivo Horn

Eiwitzuivering volgen op gel Hoe zuiverder het eiwit, des te minder bandjes op gel

Eiwitzuivering volgen door enzymatische activiteit Hoe zuiverder het enzym (=eiwit), des te hoger zijn specifieke activiteit

Werken met eiwitten = werken op ijs!!!! Invloed temperatuur Invloed pH

Invloed temperatuur Temperatuur verhoging geeft: Afname H-bruggen Toename hydrofobe interacties tot 60ºC, daarna afname Ontvouwen en expansie van eiwit Disulfide uitwisseling Eiwit aggregatie Eiwitten ‘au bain marie’ verwarmen

Invloed pH Hoe meer pH van oplossing afwijkt van pI van eiwit: Toename lading van eiwit Ontvouwen en expansie van eiwit Disulfide uitwisseling Eiwit aggregatie Eiwitten lossen beter in buffer op dan in water Toevoegen loog of zuur: voorzichtig! En bij voorkeur < 0,2 N

Stabiliserende stoffen Maken eiwitten meer compact Voorbeelden: Glycerol Sucrose Zouten: NaCl, (NH4)SO4 MPD (2-methyl-2,4-pentaandiol): kristallisatie

Bewaren van eiwitten - In droge vorm bij 4ºC Voor gebruik op KT laten komen! In oplossing (niet te lage concentratie!): bij 4ºC (lange tijd: NaN3 of filter steriliseren) bij -20ºC of -80ºC (moet eiwit wel tegen kunnen!)

Eiwitten zijn zeer gevoelig; werken met eiwitten is lastiger dan met DNA Werk daarom altijd op ijs!

De verschillende stappen voor een eiwitisolatie uit biologisch materiaal: Weefsel homogeniseren Scheiden van bestanddelen Isoleren van biomoleculen Identificeren van biomoleculen

Waarom homogeniseren bij biochemische methoden? Weefsel geschikt maken voor verdere behandeling Fijn maken van materiaal Eerste stap in de procedure van orgaan/weefsel tot molecuul

Verschillende homogenisatie methodes Blenderen Blender Drukpers French Press Teflon of Potter- Elvehjem homogenisator Sonificeren Sonificator Vriezen / ontdooien Vriezer of mengsel van droogijs/ethanol Vermalen Stamper en mortier Enzymatisch / osmose Zie ook Wilson & Walker §8.3.3 en Campbell & Farrell §5.1

Verschillende systemen Geheel intact stuk weefsel/orgaan (vb. spier, lever, hart) Biologische vloeistof (vb. bloed) Biopt Eukaryote cellen in kweek Bacteriën, gisten, schimmels

Blenderen Grof weefsel snijden/hakken Voorbehandeling Redelijke homogenisatie

Teflon homogenisator (Potter-Elvehjem) Glazen buis met teflon stamper Onder druk cellen tegen de wand van de buis drukken Cellen springen open, moleculen in oplossing Moleculen isoleren (centrifugeren) Zeer goede, voorzichtige methode (celorganellen blijven intact)

French press Celsuspensie in cilinder Hoge druk toepassen Cellen springen kapot Isolatie van vloeistof Centrifugatie om celdebris te scheiden van vloeistof met moleculen

Sonificeren Omzetting voltage in elektrische energie (20 kHz, ultrasone trillingen) Omzetting naar mechanische trillingen via probe In de vloeistof: holtes en implosies Schokgolf, destructie cellen Bacteriën, eukaryote cellen, weefsel Let op: verhitting! Altijd koelen ivm aanwezig eiwit

Mortieren Vermalen tussen glas- of aluminiumpoeder Geschikt voor kleine hoeveelheden bacteriën of gistcellen Mortieren op ijs!

Osmotisch zwellen en/of enzymatisch Hoge molariteit Osmotische zwelling cellen Cellen barsten open Sucrose/glucose EDTA helpt (desintegratie membraaneiwitten) Enzym lysozym Detergens: Triton X-100, ureum,.. Ander voorbeeld: rode bloedcellen barsten in mQ zo open.

Detergens als hulpmiddel Triton X-100 Ureum Guanidine-HCl SDS ß-mercaptoëthanol Dithiothreitol (DTT)

Ureum en guanidine Ureum vermindert hydrofobe interacties en verbreekt waterstofbruggen Guanidine-HCl werkt als ureum, maar sterker

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Anionisch detergent, bij KT bewaren (koude precipiteert SDS!) Geeft eiwit een negatieve lading SDS ontvouwt eiwitten, maar denatureert ze niet volledig! 22

Detergentia

Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) Hitte (5’, 95ºC) bevordert ontvouwing 24

Volledige eiwit denaturatie Opkoken van monster met ß-mercaptoëthanol of DTT: dit zijn sterk reducerende stoffen, die zwavelbruggen verbreken bevorderen oplosbaarheid eiwit voorkomt aggregatie analyse subeenheden mogelijk 25

Vraagje: Waarom worden detergentia gebruikt? 26

Na de homogenisatie? Verder met centrifugeren Uitzouten Dialyseren Kolomisolatie Analyse middels SDS-PAGE of blot

Centrifugeren: waarom? Verwijdering niet opgeloste stoffen Scheiding deeltjes op grootte of dichtheid Isolatie, zuivering en/of karakterisering biomoleculen

Centrifuge snelheid Hoe sneller de centrifuge draait Hoe hoger het aantal rounds per minute (rpm) Hoe sneller het water uit je was centrifugeert Hoe sneller je was droog is

Diameter centrifuge rotor Diameter beïnvloedt centrifuge proces Toename diameter Toename sedimentatiesnelheid bij gelijk aantal rpm

Centrifuge proces F = m·a a = 2·r Snelheid van het deeltje, v = ·r Versnelling van het deeltje, a = (2··n/60)2·r (Wilson & Walker: centrifugale veld, G) Toerental, n: aantal rounds per minute (rpm)

Relatie toerental / straal n: toerental in rpm r: straal in meter n2 = n1 √(r1/r2) Hoe groter de straal, hoe lager het toerental om dezelfde sedimentatiesnelheid te krijgen. Bijvoorbeeld: bij een straal r1 = 50 mm en een straal r2 = 100 mm is toerental n1 = 1000 rpm en toerental n2 = 707 rpm Als er een punt staat in de formule, dan moet dat een wortelteken zijn. Van de breuk van de beide stralen moet nl. de wortel genomen worden. (Anders klopt het voorbeeld onderaan ook niet)

RCF... Relatieve centrifugale versnelling, RCF; het aantal malen g dat bereikt wordt. Hierin wordt de centrifugering vaak uitgedrukt. Hoe reken je dan om? Versnelling van het deeltje: a = (2··n/60)2·r = (2··n/60)2·r/9,81 (1 g = 9,81 m/s2)

RPM RCF RCF = 11,18·r·(n/1000)2 Nomogram (Straal r is hier in centimeters) Nomogram

Centrifugeren als scheidingsmethode Differentiële centrifugering of pelletering Dichtheidsgradiënt centrifugering

Voorbeelden Differentiële centrifugering of pelletering: afdraaien van cellen uit je celkweek DNA of RNA precipitatie met ethanol of isopropanol Dichtheidsgradiënt centrifugering zonder gradiënt: Fenol extractie Bloed

CsCl gradiënt Scheiding van: RNA van DNA nucDNA van mtDNA Under high centrifugal force, a solution of Cesium Chloride (CsCl) molecules will dissociate and the heavy Cs+ atoms will be forcedﾊ towards the outer end of the tube, thus forming a shallow density gradient. DNA molecules placed in this gradient will migrate to the point where they have the same density as the gradient. The gradient is sufficient to separate types of DNA with slight differences in density due to differing G+C content, or physical form (e.g., linear versus circular molecules. In the experiment above, after centrifugation for 10 hrs at 100,000 rpm (450,000 xg), two distinct bands, corresponding to linear nuclear DNA above and circular mitochondrial DNA below, are visible under ultraviolet light. The separate bands are collected by poking a hole in the bottom of the tube. (SM Carr & OM Griffiths. 1987. Biochem Genet 25:385-390). Scheiding van: RNA van DNA nucDNA van mtDNA (Isopycnisch: met gradiënt)

Rotoren Uitzwaai Vaste hoek Verticaal

Rotoren Vaste hoek vs. Uitzwaai (hoekrotor en “swingout”): snellere sedimentatie in hoekrotor Deeltjes bevinden zich verder van het middelpunt van de rotor

Rotorbalans: erg belangrijk! Bij grote centrifuges geldt: Tarreren: buizen, inclusief dop, met zelfde gewicht tegenover elkaar in de rotor tot 0,1 g nauwkeurig Vullen: buizen met dop minimaal voor 2/3e vullen, anders implosie gevaar! Logboek bijhouden

Symmetrie Vaste hoek rotor Uitzwaai rotor 50 ml buizen

Symmetrie in uitzwaai rotor Goed! Fout! 10 ml buizen

In- en uitzouten Eiwitten hebben beetje zout nodig om op te lossen: Inzouten Eiwitten slaan neer bij verhoging zoutconcentratie: Uitzouten Zoutconcentratie nodig voor eiwitprecipitatie, is voor elk eiwit anders

Zoutprecipitatie Neerslaan eiwit door verhoging zoutconcentratie Fractionele precipitatie Neerslaan eiwit door verhoging zoutconcentratie Ammoniumsulfaat precipitatie ((NH4)2SO4 ) Alle eiwitten reageren verschillend op verschillende concentraties zouten kleinere eiwitten en eiwitten met meer geladen aminozuren lossen beter op Afdraaien (centrifugeren) Geprecipiteerd eiwit zit in pellet en overige eiwitten in supernatant

Zoutprecipitatie A280: Absorptie van eiwit bij 280 nm in spectrofotometer

Zoutprecipitatie Waar is het enzym en waar de overige eiwitten?

Dialyse Voor verwijdering van zout of kleine organische moleculen

Diffusie

Dialyse-membraan Semipermeabel Verschillende porie grootte (zowel in 1 membraan als tussen verschillende membranen) Soms voorbehandeling nodig met NaHCO3 en EDTA Vb. Cellulose

Ultrafiltratie Centricon Advantec