Imeldaziekenhuis Bonheiden Hemoglobine A1c Inge Thoelen Imeldaziekenhuis Bonheiden

Historiek 1955: glycohemoglobine voor het eerst aangetoond als snelle Hb component op elektroforese

Historiek

Wat is HbA1c? Niet-enzymatische glyceringsreactie : irreversibele binding van glucose aan het N-terminale valine van de b-keten

Glycohemoglobine varianten Hemoglobine (Hb) HbA (a2b2) HbF (a2g2) HbA2 (a2d2) (0,5% van Hb) (2,5% van Hb) (97% van Hb) HbA1 (6% van HbA) HbA0 (94% van HbA) HbA1c (5% van HbA) HbA1b (0,4% van HbA) HbA1a HbA1a2 (0,2% van HbA) HbA1a1

Klinische betekenis [HbA1c]  gemiddelde glycemie tijdens de voorbije 120 dagen (=gemiddelde levensduur RBC) Lineair verband tussen HbA1c en gemiddelde glucosespiegel:  1% HbA1c   35 mg/dl plasma glucose Niet beïnvloed door recente inspanning of voedselinname 95% BI Reference range

Diabetes Mellitus Gekarakteriseerd door hyperglycemie Classificatie in verschillende types: Type 1 diabetes (5-10%) : absolute insuline deficiëntie Type 2 diabetes (>80%) : variabele graad van insuline deficiëntie en resistentie Andere specifieke types (overige) : genetische defecten bèta-cel functie, genetische defecten insuline en de insuline- receptor, ziekten van de exocriene pancreas, endocrinopathies, virale infecties, drug-induced, … Zwangerschapsdiabetes

Prospectieve studies DCCT: Diabetes Control and Complications Trial The Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) is a randomized, controlled clinical trial designed to assess the relationship between glycemic control and the development, progression, or amelioration of early vascular complications in persons with insulin-dependent diabetes mellitus (IDDM). [Diabetes. 1986 May;35(5):530-45.] UKPDS: UK Prospective Diabetes Study UK prospective study of therapies of maturity-onset diabetes. I. Effect of diet, sulphonylurea, insulin or biguanide therapy on fasting plasma glucose and body weight over one year. [Diabetologia. 1983 Jun;24(6):404-11.]

Prospectieve studies Belangrijkste resultaten DCCT (1983-1993, USA + Canada) Intensieve behandeling door verlagen bloed glucose reduceert het risico op retinopathie met 76%, op nefropathie met 50% en op neuropathie met 60%. UKPDS (1977-1997, Groot-Brittannië + Schotland) Intensieve bloed glucose controle reduceert het risico op retinopathie met een kwart en op nefropathie met een derde. Betere bloeddruk controle reduceert het risico op macrovasculaire complicaties met meer dan een derde.

Intensieve therapie DCCT Prospectieve studies Intensieve therapie DCCT Multipele insuline-inspuitingen dagelijks (4x) of insuline-pompje Frequente dagelijkse zelf-monitoring bloed glucose (>4x) Insuline dosis-aanpassingen naargelang voeding en activiteit Schema voor dieet en activiteit Maandelijkse consultatie arts Cave hypoglycemie!!

Aanbevelingen American Diabetes Association (ADA): Prospectieve studies HbA1c: verband met de gemiddelde diabetesregeling werd bevestigd HbA1c: belangrijke voorspeller van diabetescomplicaties Aanbevelingen American Diabetes Association (ADA): - Streven naar een gemiddelde HbA1c-waarde < 7 - [Intensivering therapie als HbA1c-waarde > 8!]

Klinisch nut HbA1c Evaluatie glycemieregeling individuele patiënt: (minimum twee metingen per jaar) Evaluatie glycemieregeling groep patiënten: vergelijkende studies (bijv. IKED) Evaluatie van het risico op diabetescomplicaties Belangrijke parameter inzake de noodzaak voor therapie-aanpassingen Diagnostiek van diabetes: nog niet opgenomen in de huidige diagnostische richtlijnen (hoge specificiteit - lage gevoeligheid; gebrek aan internationale standaardisatie)

Bepalingsmethoden HbA1c Meer dan 20 verschillende bepalingsmethoden voor HbA1c, gebaseerd op verschillen in lading of structuur Ongeacht de methode wordt het resultaat uitgedrukt als percentage van totaal Hb Volgens internationaal ringonderzoek in 2002 worden volgende scheikundige principes het meest gehanteerd: verschil in iso-elektrisch punt: ionenuitwisselings- chromatografie of HPLC (66%) specifiek antilichaam: immunochemische methoden (29%) elektroforese, affiniteitschromatografie (5%)

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) HA-8140 HA-8160 Menarini Diagnostics

High Performance Liquid Chromatography (HPLC)

Chromatogram printouts HA-8140 HA-8160

Interferenties met de HbA1c-bepaling Labiele fractie 2. Gecarbamyleerd hemoglobine 3. Geacetyleerd hemoglobine Glucose + Hb Schiffse base HbA1c snel traag labiel - onderhevig aan acute veranderingen in [glucose] - geeft vals verhoogde resultaten Ureum Ammonium + Cyanaat Isocyanaat + Hb Carbamyl-Hb - geeft vals verhoogde resultaten - goede nierfunctie: ± 0.3% carbamyl-Hb - slechte nierfunctie (diabeten!): tot 3% carbamyl-Hb Bij chronisch gebruik van hoge dosissen salicylaten (Aspirine®) kan acetyl-Hb gevormd worden hetgeen een positieve interferentie tot gevolg kan hebben.

Interferenties met de HbA1c-bepaling 4. Hemoglobine-varianten 5. Foetaal hemoglobine (HbF) T.g.v. migratie en gemengde huwelijken: stijgend aantal hemoglobinopathieën in België Meestal heterozygoten met fenotype HbAS, soms ook AC, AD, … HbA1c in dergelijk geval berekenen als percentage van totaal HbA en niet van totaal Hb, anders vals verlaagde waarden In normale omstandigheden bedraagt HbF slechts ± 0.5% van totaal Hb en is zijn invloed op de HbA1c bepaling te verwaarlozen In bepaalde omstandigheden (kinderen jonger dan 6 maanden, ‘hereditary persistence of fetal hemoglobin’, beta-thalassemie, sikkelcelanemie, …) is het HbF-gehalte veel hoger en bijgevolg oorzaak van vals verlaagde HbA1c- waarden

Interferenties met de HbA1c-bepaling 6. Overige: HbA1c-gehalte afhankelijk van de levensduur van de RBC!! Hemolytische anemie, HbSS, HbSC, …: levensduur RBC : daling HbA1c Aanzienlijk bloedverlies: reticulocyten : daling HbA1c Ferriprieve anemie, splenectomie: fractie oude RBC : stijging HbA1c Bepaling fructosamine (index voor geglyceerde serumeiwitten) beter alternatief!?

Voordelen HA-8160 t.o.v. HA-8140 Totale afscheiding van het carbamyl-Hb en het acetyl-Hb in een afzonderlijke piekfractie (schouder op HA-8140) Totale afscheiding van de labiele fractie op de kolom (gelijktijdig met de carbamyl-fractie): sneller en beter dan voorafgaandelijke scheikundige eliminatie op HA-8140 Twee programma’s mogelijk: ‘Mode VP’ voor de klassieke HbA1c routine, ‘Mode TP’ voor b-thalassemie screening met kwantificatie van HbA2 Detectie en kwantificatie van meerdere hemoglobinevarianten (S, C, D, E, H, …) en automatische correctie van de HbA1c-waarde (HA-8140 enkel HbS en HbC met gebrekkige resolutie) HbF-piek wordt niet meegerekend in het totaal Hb Afzonderlijke racks voor volbloed- en gehemolyseerde stalen Elektronische detectie niveau eluenten

Voordelen HA-8160 t.o.v. HA-8140 HA-8160 is vol-automatisch: dagelijks manueel ontluchten is niet meer nodig HA-8160 is sneller (2.9 minuten per staal t.o.v. 4.0 op de HA-8140) HA-8160 is compacter en eenvoudiger in gebruik dan HA-8140 Betere resultaten, betere CV’s

Analytische validatie HA-8160 Correlatie met HA-8140 N=22 R=0.9912 Aanvankelijk N=30 8 outliers verworpen o.w.v. carbamylpiek of ‘hoog’ HbF-gehalte

Analytische validatie HA-8160 Reproduceerbaarheid Within run precisie N=22 (duplobepalingen) Gemiddelde CV=0.50%

Analytische validatie HA-8160 Reproduceerbaarheid Between run precisie Level 1 Level 2 N=21 Level 1 (11%): CV=0.88% Level 2 (6%): CV=1.58%

Analytische validatie HA-8160 Lineariteit N=11 R=0.9986 Staal HbA1c 11,5% oplopend verdunnen met staal HbA1c 5,6% Testgebied van 5,6% tot 11,5%

te evalueren methode: HA-8160 Analytische validatie HA-8160 Juistheid/Interferenties staal interferens referentie- methode   te evalueren methode: HA-8160 HA-8160 HA-8140 waarde (%) X1 (%) X2 (%) mean (%) AFW (%) EKE-137 5,2 5,3 +0,1 0,0 EKE-149 8,1 8,3 +0,2 7,9 -0,2 EKE-139 10,3 10,6 10,5 +0,3 9,9 -0,4 EKE-140 1,5% carbamyl-Hb 5,0 -0,3 6,6 +1,3 EKE-155 3% carbamyl-Hb 5,1 5,7 +0,4 EKE-143 AC-variant 5,6 5,5 -0,1 5,8 EKE-147 AS-variant

Analytische validatie HA-8160 Vergelijking chromatogrammen carbamyl-Hb HA-8140 HA-8160

Analytische validatie HA-8160 Vergelijking chromatogrammen Hb AS-variant HA-8140 HA-8160

Analytische validatie HA-8160 Samenvatting Parameter Waarde Interpretatie Correlatie met HA-8140 (R) (n=22) R=0,9912 Goed Within-run reproduceerbaarheid CV% 0,50% Uitstekend Between-run reproduceerbaarheid CV% level 6% 1,58% Between-run reproduceerbaarheid CV% level 11% 0,88% Lineariteit (R) R=0,9986 Afwijking/Juistheid 5,2% +0,1% Afwijking/Juistheid 8,1% +0,2% Afwijking/Juistheid 10,3% +0,3% Interferentie 1,5% gecarbamyleerd Hb -0,3% Interferentie 3% gecarbamyleerd Hb -0,2% Interferentie Hb AC-variant -0,1% Interferentie Hb AS-variant -0,4% Carry-over   GEEN Referentiewaarden (n=20) 1 outlier (6,1%) 5%-6%

Lichtgrijs: alle labo’s EKE dagrapport 2003 HA-8140 5.3% 5.6% 6.0% 6.6% N=324 Lichtgrijs: alle labo’s Donkergrijs: HA-8140

uitstekend onacceptabel goed goed goed uitstekend goed slecht EKE jaarrapport 2003 HA-8140/8160 onderwerp Uw lab 8140 alle laboratoria aantal laboratoria 1 94 411 juistheid afwijking van DCCT voor 5% DCCT level voor 8% DCCT level voor 11% DCCT level afwijking van IFCC voor 5% DCCT level voor 8% DCCT level voor 11% DCCT level -0.1% -0.3% -0.4% 1.8% 1.3% 0.9% -0.2% -0.2% -0.2% 1.7% 1.4% 1.1% -0.1% -0.2% -0.2% 1.8% 1.4% 1.1% reproduceerbaarheid variatie-coefficient 2.6% 2.5% 2.9% lineariteit correlatie-coefficient 0.9937 0.9914 interferenties - Hemoglobin Derivative: Carbamylated Hb elevated, about 1,5% - Hemoglobin Variant: Heterozygous for C (Type AC, 35% hemoglobin C) - Hemoglobin Variant: Heterozygous for S (Type AS, 35% hemoglobin S) - Hemoglobin Derivative: Carbamylated Hb, about 3% 1.3% 0.2% 0.0% 0.4% 0.4% -0.0% 0.5% 1.1% -0.0% 0.2% 0.1% 0.8% interpretatie afwijking van DCCT (afwijking van IFCC reproduceerbaarheid lineariteit interferenties - Hemoglobin Derivative: Carbamylated Hb elevated, about 1,5% - Hemoglobin Variant: Heterozygous for C (Type AC, 35% hemoglobin C) - Hemoglobin Variant: Heterozygous for S (Type AS, 35% hemoglobin S) - Hemoglobin Derivative: Carbamylated Hb, about 3%   uitstekend onacceptabel goed goed   onacceptabel uitstekend uitstekend goed   uitstekend onacceptabel goed goed   goed uitstekend goed slecht   uitstekend onacceptabel goed goed   uitstekend uitstekend uitstekend acceptabel 8160 29 -0.1% -0.1% -0.2% 1.8% 1.5% 1.1% 1.9% 0.9978 -0.3% -0.1% -0.4% -0.3%   uitstekend onacceptabel ) uitstekend uitstekend   uitstekend uitstekend goed uitstekend WIV

Precisie en biologische variatie HbA1c Een hoge analytische precisie is een absolute vereiste bij meting van parameter voor monitoring om significante veranderingen t.o.v. vorige metingen aan te tonen Intra-laboratorium variatiecoëfficiënt (CV) kleiner dan 3% voor HbA1c-meting wordt aanbevolen Voorbeeld: indien CV=3% en gemeten HbA1c-waarde = 7.5%, dan ligt correcte resultaat met 95% zekerheid tussen 7.0% en 8.0% en een verandering binnen die marges is dus niet significant Intra-individuele biologische variatie ook in rekening brengen: 2-3% voor HbA1c → recent werd daarom gesteld van absolute veranderingen tot 0.5% niet als relevant te beschouwen Inter-individuele biologische variatie HbA1c: 7.2% → weerspiegeld in normale populatie-range (4%-6%)

Standaardisatie HbA1c HbA1c is een risicofactor voor diabetes-complicaties Essentieel om resultaten van verschillende laboratoria te kunnen vergelijken: behoefte aan standaardisatie NGSP (National Glycohemoglobin Standardization Program) opgericht in USA in 1996 met als doel: “The purpose of the NGSP is to standardize glycated hemoglobin test results so that clinical laboratory results are comparable to those reported in the Diabetes Control and Complications Trial (DCCT) where relationships to mean blood glucose and risk for vascular complications have been established.” Momenteel DCCT-standaard (HPLC = referentiemethode) algemeen verspreid in USA, West-Europa, Australië,… met procedures en kalibratoren die NGSP-gecertificeerd zijn Sommige landen eigen nationale HbA1c-standaardisatie: Japan, Zweden

Standaardisatie HbA1c IFCC (International Federation of Clinical Chemistry) heeft werkgroep opgericht rond wereldwijde harmonisatie van HbA1c: nieuw referentie-anker voorgesteld (referentiemethode: massaspectrometrie en capillaire elektroforese) met gebruik van zuiver HbA1c en HbA0 als primair referentiemateriaal IFCC-waarden 1.5%-2% lager dan DCCT-waarden (normale populatie-range IFCC: 2.9%-4.2%) IFCC-referentiesysteem is technisch klaar voor implementatie maar hoe presenteren aan clinici en patiënten?

Bepalingen HbA1c in IZ Bonheiden Prijs per test aangerekend door firma : 2.09 €/test 194 HbA1c-bepalingen op 14 dagen (16- 30/06/2004): ± 14 stalen per dag Slechts 8% binnen de normale grenzen (4%-6%) 8% 28% 31% 15% 11% 4% 0,5% 2% Uitstekend Matig Goed Slecht

Conclusies HbA1c Menarini HA-8160 HbA1c auto-analyzer: gemakkelijker in gebruik en betere resultaten dan HA-8140 HPLC en immuno-assays zijn veruit de meest gebruikte methoden voor HbA1c-bepaling waarbij chromatografische methoden het best scoren op reproduceerbaarheid Meerderheid van de laboratoria zijn DCCT-gestandaardiseerd (vrijwel alle Belgische laboratoria) Imprecisie < 3% voor zinvolle interpretatie van opeenvolgende resultaten Kennis van mogelijk storende factoren is belangrijk (uremie, hemoglobinopathie, hoog aspirine-gebruik, ferriprieve anemie, …) : melden naar artsen toe en omgekeerd? HbA1c is de beste parameter voor de monitoring van de glycemiecontrole bij diabetespatiënten IFCC-referentiesysteem zal de kwaliteit van de HbA1c-bepaling gevoelig verbeteren, doch blijven weergeven in DCCT-waarden?