Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie De Smet Mr. Wim Goeteyn Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse

Overzicht Doel Algemene richtlijnen Technieken Uit te voeren proeven

= bepaling van endogene componenten in een Doel = bepaling van endogene componenten in een biologische matrix... Bloed Urine Punctievocht Etc. Serum / Plasma Complicatie: vele andere, gelijkaardige componenten aanwezig dikwijls in veel  conc.  nood aan SELECTIVITEIT SENSITIVITEIT …om pathologische toestanden op te sporen en/of te bevestigen

Bloed STOLLING GEEN STOLLING Prop: cellulair materiaal SERUM: helder Afname zonder anticoagulans  STOLLING uitzakking of centrifugatie Afname met anticoagulans  GEEN STOLLING Prop: cellulair materiaal stollingsEW SERUM: helder supernatans RBC, WBC PLASMA

Anticoagulans Voorbeelden: = antistollingsmiddel wordt toegevoegd aan proefbuis voor bloedafname Voorbeelden: NaF NaCitraat EDTA Heparine F- inhibeert de enzymatische activiteit Complexatie Ca2+ Prothrombine thrombine

Bepaling van… een targetcomponent creatinine, bilirubine, ureum, cholesterol... een enzymactiviteit Alkalische fosfatase, LDH, …

Bepaling van een targetcomponent Algemene strategie Monster: ontdooien  mengen ! Deproteïniseren: = hogere structuren van proteïnen H2SO4, TCA, EtOH Centrifugeren

Spectrofotometrie Fluorimetrie Supernatans: = bovenstaande vloeistof moet steeds HELDER zijn! Spectrofotometrie Fluorimetrie - na chemische kleurreactie bilirubine, glucose colorimetrisch Phenylalanine - na enzymatische omzetting glucose enzymatisch

Bepaling van een enzymactiviteit  bepaling van targetcomponent uitvoering op speciale spectrofotometers rekening houden met chemische structuur Michaëlis-Menten !!!! meestal kinetische bepaling - overmaat substraat toevoegen - hoev. substraat afgebroken/ tijdseenheid of hoev. product gevormd/ tijdseenheid  spectrofotometrisch volgen - enzymactiviteit berekenen

0de orde: overmaat substraat Reactie- snelheid 0de orde: overmaat substraat bepalen van enzymactiviteit Conc. Substraat 1ste orde: overmaat enzyme bepalen van substraat (targetcomponent)

Algemene Richtlijnen !! steeds HOMOGENISEREN: omzwenken Stalen 1 plasmastaal ( 9 mL) gedurende volledig practicum bewaren onmiddellijk na gebruik in de ijskast niet in de zon laten staan zilverpapier rond staal: zelf meebrengen (bilirubine breekt af o.i.v. licht) !! steeds HOMOGENISEREN: omzwenken niet schudden

STEEDS op de dag zelf ter beschikking gesteld 1 bloedstaal  hematologie STEEDS op de dag zelf ter beschikking gesteld Opmerking: Handschoenen!

Materiaal Plastiek box Chronometers Knikkers Zelf meebrengen lijst controleren bij begin practicum Chronometers Knikkers Zelf meebrengen Zilverpapier Spectrofotometers steeds aangeduid toestel gebruiken ALLEEN plastieken cuvetten gebruiken cuvetten voorspoelen

     =   =  Centrifuges  STEEDS symmetrisch vullen Indien nodig: evenwicht door toevoegen van een buis water STEEDS centrifugeerbuizen merken!       =   = 

Reagentia Standaarden: Producten aan weegschaal: Vloeibare reagentia: meestal 1 per groep correcte concentratie gebruiken in de berekening nooit voorspoelen met standaardoplossingen contaminatie vermijden! ijskast! Producten aan weegschaal: droog houden: deksels op potten!! Vloeibare reagentia: flessen afsluiten met juiste stoppen  contaminatie! Kits: zuinig zijn!! (LDH en glucose enzymatisch slechts 1x uitvoeren)

Verslagen Geen papieren verslagen meer Resultaten in SI-units (zie omrekeningstabel, bijlage 2) Resultaten in computer ingeven, LOGIN en PASWOORD worden samen met staal geleverd.

Algemeen - Milieu - Veiligheid Proper werken - ‘s Avonds opruimen (trekkasten, microscopen!) GEEN jassen, GEEN boekentassen LABOJAS verplicht VEILIGHEIDSBRIL NIET met de mond pipetteren (peer) MILIEU!!! GEEN reagentia in wasbakken (ook niet vanuit cuvetten), enkel in afvalvaten

Voorbereiding: Dagelijks ondervraging mogelijk Zowel schriftelijk als mondeling Geen examenproef, dus GOED WERKEN Resultaat practicum telt voor 25% mee in het eindresultaat van het opleidingsonderdeel Medische Biochemie !!!!

Technieken Spectrofotometrie

 Intensiteit lichtstraal daalt. Spectrofotometrie Lichtstraal van bepaalde energie ( E 1/ ) die door een oplossing wordt gestuurd zal met de moleculen van die oplossing interactie vertonen.  De buitenste electronen van de moleculen worden door de EMS naar een hogere energietoestand gebracht.  Intensiteit lichtstraal daalt. dI I0 Intensiteit I Afstand

 N* - dI  I0 met I0 E = log =  . M . l I E = extinctie via mathematische afleiding: Wet van Lambert-Beer I0 E = log =  . M . l I E = extinctie  = molaire extinctiecoëfficiënt M = molariteit v/d oplossing l = weglengte I0 = oorspronkelijke intensiteit N* = # absorberende deeltjes / cm2 doorsnede

Spectrofotometer: schematisch - onderdelen 1. lichtbron (UV, of zichtbaar) 2. golflengteselector 3. cuvet (glas,plastiek of quartz) 4. intensiteitsmeter (fotogevoelige cel) - meestal 2 schaaluitdrukkingen: T en E E = log 1 / T I detector I0 1 2 3 4

  Doel = Concentratiemetingen Ex Cx 1. met 1 bekende en een onbekende: 1-puntscalibratie Ex  Cx Ex Cx = Est  Cst Est Cst 2. met reeks bekenden en onbekende: ijklijn Ex . Cst Est   Cx = E4 E3 E2 E1 y = ax + b Ex C1 C2 C3 C4 Cx

Proeven Medische achtergrond Praktische aspecten

HEMATOLOGIE RBC of erythrocyten: WBC of leucocyten: Aantal Leucocytaire formule

RBC Anemie Polycythemie # RBC en/of Hb  # RBC en/of Hb  Overmatig bloedverlies Hemolytische anemie Defecte bloedaanmaak Fysiologisch: bewoners hooggebergte of hoogtestage  O2-gebrek  EPO  Pathologisch: t.g.v. beenmerg- of niertumor

WBC Onmisbare rol in het afweermechanisme Pathologie: Leucopenie Leucocytose # WBC < 4000 # WBC > 10000  Differentiatie  leucocytaire formule Vb. # granulocyten < 1000/ µL  infectiegevaar 

Praktisch VOLBLOED: de dag zelf ter beschikking Tellen RBC: Telkamer van Bürker: 2 kamers per draagglas Hayemopl.: bevat HgCl2 (GIFTIG) Leucocytaire formule: Geen dekglaasje, maar een dr. immersie-olie Microscopen: Lenzen ev. schoonmaken met xylol Voorwerpglaasje NIET raken met lens

UREUM Degradatie van ANZ  afsplitsing a-NH2-groep  trans- of de-aminatie-reactie Elk metaboliserend weefsel produceert NH4+  toxisch Ureum- of ornithinecyclus Omzetting NH4+-ionen tot ureum in lever Minder toxisch Gemakkelijke eliminatie langs nier Uremie  nierfunctie testen N-bevattende eindprodukten  urine

Praktisch Proefbuizen afsluiten met knikker  bediende TIMING!!!

BILIRUBINE Hb (MW: 64450): Tetrameer = 4 HEEM groepen + 4 GLOBINE ketens Drager van O2 Biodegradatie Hb (lever): Splitsing in heem en globine Proteïnedeel  proteïne-catabolisme Heem  bilirubine  glucuronidatie (gal)  darm: faeces urine

Praktisch Geelzucht of icterus Hyperbilirubinemie: opstapeling bilirubine t.g.v. levercelbeschadiging obstructie van de galafvoer Praktisch Bilirubine: lichtgevoelig  zilverpapier Enkel totaal bilirubine wordt bepaald Diazo II en diazoreagens: zelf maken Ijklijn: zie p. 37

CREATININE Creatine: glycine + arginine + methionine belangrijke spierconstituent Fosfocreatine: ° spieren in rust ogenblikkelijke E-leverancier voor spiercontracties cycliseert spontaan tot creatinine Creatinine: nutteloos afvalprodukt uitscheiding door nier Creatininemie  o.a. nierinsufficiëntie

Praktisch Creatinine stockstandaard :  frigo  nog verdunnen MIN. 1u incuberen Alk. picraatreagens vlak voor gebruik bereiden Natriumtungstaat = natriumwolframaat

ELEKTROFORESE Praktisch %-samenstelling van de EW Albumine Diverse globulines (o.a.  -globulines  immunologische reflex)  afwijking: indicatie pathologie Scheiding: gebaseerd op differentiële migratie van geladen EW in een elektrisch veld (zie ook item in Webcourse) Praktisch Let op: elektroforesekamer in werking  220V reagens om strips op te lossen is sterk zuur  peer

GLUCOSE De onmiddellijke E-bron bij uitstek voor de cellen bij overmaat: start glucose consumptie glycogenese, glycolyse, lipogenese bij tekort: start glucose productie gycogenolyse, gluconeogenese, interconversie dirigenten: insuline + glucagon Diabetes Mellitus of suikerziekte: basisdefect:  insuline biochemisch: hyperglycemie glycosurie ketogenese en acidose  klinische symptomen

Bepalingen Hexokinasemethode: meest specifieke methode glucose enzymatisch hexokinase glucose glucose-6-P ATP ADP G-6-fofaat-DH glucose-6-P + NADP+ 6-fosfogluconaat + NADPH + H+ NADPH  spectrofotometrisch van NADP+ * Slechts 1 X per student * TIMING * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans

Colorimetrische methode: Somogyi-Nelson glucose colorimetrisch  van eiwitten kleurvorming gebaseerd op reducerende eigenschappen * arsenomolybdaat-reagens: giftig, gebruik dispenser * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans

ENZYMACTIVITEITSBEPALINGEN Frequent uitgevoerd in het klinisch labo Soorten plasma-enzymen: Plasma-specifieke Niet-specifieke = enzymen van cellulair metabolisme conc plasma > conc cellen specifieke functie aanmaak in lever conc plasma  bij leverdeficiëntie specifieke voor weefsel of orgaan conc plasma  bij celbeschadeging vb. ADH in levercellen

Alkalische fosfatase (ALP) Opsporing van o.a. lever- en botafwijkingen p-nitrophenylfosfaat p-nitrophenol Absorbtie van p-nitrophenol bij 405 nm WWB 30°C Opletten: bij 37° C denatureert ALP! Praktisch Niet te lang!