CAT opsporen van parasieten in faeces: wat en voor wie? Kristien Van Vaerenbergh 21 januari 2005 Supervisor: Prof. Dr. K. Lagrou Search verified by Dr. J. Frans

Parasieten in faeces Voor wie is deze analyse van toepassing? Optimale voorwaarden voor parasieten onderzoek in faeces Beschikbare methoden Wat kan er concreet aangeboden worden? -2004 -toekomst

IDSA richtlijnen: Management of Infectious Diarrhea (2001) Steeds breder wordend arsenaal van pathogenen met toegenomen diagnostische mogelijkheden Evaluatie en management van infectieuse diarree moet kosten-efficiënt zijn

IDSA richtlijnen: Management of Infectious Diarrhea (2001)

Voor wie van toepassing?

Voor wie van toepassing? Selectieve aanpak van diarree: Community-acquired diarree Reizigersdiarree Hospital-acquired diarree Persisterende diarree (> 7 dagen) zeker indien immuungecompromitteerd

Voor wie van toepassing? De meeste episodes van acute ‘community-acquired’ diarree viraal / zelflimiterend / van korte duur : microbiologisch onderzoek binnen de 24 uur na aanvang zelden van toepassing

Voor wie van toepassing? Reizigersdiarree: risico is sterk afhankelijk van reisbestemming Meestal: acuut probleem, vaak bacterieel Acute diarree <2 weken verwekkers Viraal Calicivirussen (Norwalk), rotavirus, enterovirus 5 tot 10 % Bacterieel enterotoxigene E. coli, Campylobacter jejuni, Shigella species, Salmonella species, Vibrio, Aeromonas, Pleisiomonas, Clostridium difficile 50 tot 75% Parasitair Giardia lamblia, Cryptosporidium parvum, Entamoeba histolytica, Cyclospora cayetensis, Isospora belli tot 5 %

Voor wie van toepassing? Chronische reizigersdiarree: langer dan twee weken bij 10% van de reizigers – parasieten wel belangrijk Chronische diarree verwekkers Bacterieel cfr supra –ook Yersinia zz Fungi Histoplama capsulatum zz (respiratoire S) Parasitair Giardia lamblia Cryptosporidium parvum Entamoeba histolytica Cyclospora cayetensis Isospora belli Microsporidium tot 30 % waterige diarree bloederige d, T° waterige d, T° eosinofilie immuundeficiëntie

Voor wie van toepassing? acute ‘community-acquired’ diarree en acute reizigersdiarree: - indien faeces onderzoek: faeces cultuur, evt EHEC - C. difficile kan van toepassing zijn

Nosocomiale diarree Tijdens de eerste 3 dagen van hospitalisatie ~ ‘community-acquired diarrhea’ Vaak niet-infectieus: tgv medicatie, parenterale voeding Ontstaan na de eerste 3 dagen van hospitalisatie: C. difficile uitsluiten Parasieten onderzoek en klassieke faeces cultuur uitermate lage opbrengst bij patiënten die diarree ontwikkelen na de eerste 3 hospitalisatiedagen, ook in pediatrische populaties Kan wel bij verdere investigatie van ‘community-acquired’ diarree

Persisterende diarree Uitsluiten van parasieten, zeker indien immuungecompromitteerd: Giardia Cryptosporidium Entamoeba histolytica Cyclospora Isospora belli Bijkomend bij HIV: Microsporidia Bijkomend bij TX-kandidaten: Strongyloides stercoralis uitsluiten

Persisterende diarree - HIV Vóór de periode van HAART: diarree frequente complicatie van HIV-infectie; chronische diarree verantwoordelijk voor 17 % nieuwe AIDS-diagnoses bij CDC Dankzij HAART: dramatische afname van incidentie van diarree (cfr andere opportunistische infecties) Conservatieve houding immunologisch herstel vaak genezing chronische diarree; herval bij falen R/ Diarree bij HIV vaak infectieus van oorzaak: virulente kiemen bij intacte afweer/ immuundeficiëntie; ook minder virulente kiemen bij gevorderde HIV/AIDS

Persisterende diarree - HIV Up to date

Persisterende diarree - HIV Oldfield E., Reviews in gastroenterological disorders, 2002.

Microsporidia Opportunistische pathogeen HIV: belangrijke verwekker van chronische diarree bij CD4 < 100/ul Ook bij TX, reizigers, ouderlingen Obligate intracellulaire sporenvormer; Vooral Enterocytozoon bieneusi, Encephalitozoon species; resistente sporen Wereldwijd voorkomen

Microsporidia Transmissie: feco-oraal, evt via urine; minimum aantal sporen nodig? S: vooral gastro-intestinaal, ook genito-urinair, respiratoir, gedissemineerd D: sporen zeer klein (1-2 um) geen effectieve concentratietechnieken; gemodifieerde trichroomkleuring, fluorescentie technieken (FungiFluor, Calcofluor white); gouden standaard electronenmicroscopie; sensitiviteit van gemod. Trichroom en Calcofluor tov EM 100%, specificiteit ongeveer 80%. R/ Immunologisch herstel belangrijk voor genezing, naast chronische, antiparasitaire therapie (albendazole voor Encephalitozoon infecties)

Microsporidia Spore injecteert infectieuse sporoplasma in gastheercel via polaire filament multiplicatie via ‘binary/multiple fission’ maturatie van sporen Spore in faeces zeer klein (1-2 um)

Microsporidia Chromotroop 2R kleuring: zwarte pijl: E. bieneusi sporen gele pijl: gevacuoliseerde spore rode pijl: gist CDC

Cryptosporidium - Isospora belli - Cyclospora Cryptosporidium parvum : samen met Giardia belangrijke parasitaire darmpathogeen klinisch beeld variabel, vooral waterige diarree (zelflimiterend indien immuuncompetent, tot chronisch bij AIDS) vaak jonge kinderen feco-oraal; via gecontamineerd water of voedsel D/ oöcyste 3-4 um: gemodif. zuurvaste kleuring/ auramine/ safranine/ antigendetectie R/ immuunreconstitutie

Cryptosporidium - Isospora belli - Cyclospora Cyclospora cayetanensis: Was vroeger al opgemerkt in faeces ‘blauw-groene algen’ wereldwijd voorkomen diarree bij reizigers, bij AIDS - patiënten, food - borne outbreaks Zelflimiterende tot aanslepende diarree; AIDS cfr Cryptosporidium en Isospora D/ gemodifieerde zuurvaste kleuring autofluorescentie, safranine R/ SXT Niet gekleurd - M. Lontie

Cryptosporidium - Isospora belli - Cyclospora Cyclospora cayetanensis: oöcysten 8 tot 10 um oöcysten hebben enkele dagen nodig na excretie voor ze infectieus zijn (ontwikkeling van gesporuleerde oöcysten)

Cryptosporidium - Isospora belli- Cyclospora minst frequente van de drie wereldwijd voorkomen, outbreaks gerapporteerd vooral bij immuungedeprimeerden AIDS: aanslepende waterige diarree, wasting cfr Cryptosporidium kinderen: ernstige diarree R/ immuunreconstitutie; SXT

Cryptosporidium - Isospora belli- Cyclospora Isospora belli: typische, ellipsoïdale oöcyste, groot (25-30 um)

. A, C en E: gemodifieerde zuurvaste kleuring . B, D en G: bright field microscopy . E, H: UV flurescentie – autofluorescentie (Cryptosporidium niet)

Strongyloides stercoralis Moet altijd uitgesloten worden bij Tx-kandidaten, indien verblijf in endemische regio in voorgeschiedenis Endemische regio: ZO-Azië, Latijns-Amerika, zuidoostelijke staten VS, ook Turkije en Noord-Italië Chronische infectie: - onopvallend - GI, pulmonale, cutane S, eosinofilie - symptomen kunnen jaren persisteren Diagnose: - detectie larven in faeces (rechtstreeks, na concentratie) : na 3 stalen sensitiviteit 50% - Baermann concentratie, cultuur: zz in routine - serologie: sensitiviteit en specificiteit > 90 % - microscopische detectie en serologie zijn complementair

Strongyloides stercoralis: rhabditoid larva (unstained). M.Lontie

Strongyloides stercoralis

Strongyloides stercoralis

Strongyloides stercoralis autoinfectie: penetratie van perianale huid of colonmucosa door rhabditiforme larven, wat kan leiden tot hyperinfectie en gedissemineerde ziekte (bacteriëmie, meningitis – zeer hoge mortaliteit) Immuunsuppressie (ook corticosteroiden) risicofactor voor hyperinfectie ! Alvorens te starten Strongyloides uitsluiten ook van belang bij HIV- en HTLV-infectie therapie: thiabendazole, ivermectin

Dientamoeba fragilis Behoort tot flagellaten (“the unflagellated human flagellate “); nog geen cystevorm gekend Trofozoiet: fragiel, 1 of 2 kernen met 4-6 granules, 5-15 um Wereldwijd voorkomen Diagnose: fixatie en permanente kleuring, zoniet geen detectie van fragiele trofozoiet; intermittente aanwezigheid; vaak miskend Transmissie ? Vaak samen aanwezig met Enterobius vermicularis Pathogeniciteit lang betwijfeld; incubatieperiode? Proportie asymptomatische infecties?

Dientamoeba fragilis Symptomen: abdominale pijn (kan persisteren gedurende jaren), diarree, anorexie, moeheid, nausea, vermagering; regressie van S na therapie Infecties bij kinderen frequent: -vaak milde infecties: seroposotiviteit 91% bij gezonde, Canadese kinderen (Chan et al, 1996) - vaker symptomatisch dan bij volwassene - eosinofilie Therapie: Paromomycine, tetracycline, metronidazole

Dientamoeba fragilis

Dientamoeba fragilis geen cyste vorm gekend, trofozoiet 1 of 2 kernen, 5-15 um, polymorf fixatie en permanente kleuring (ijzer-hematoxiline; trichroom) DD Endolimax nana, E. hartmanni

Optimale voorwaarden opzoeken parasieten in faeces Collectietijden en aantal stalen: 3 stalen over een perioden van 7 tot 10 dagen owv intermittente aanwezigheid en variabele #; Geen collectie van meerdere stalen op dezelfde dag Tijdsframe: verse preparaten voor beweeglijke protozoa: kans het grootst in vloeibare stalen, bekijken binnen het half uur na produktie! Zoniet, fixeer- middel gebruiken. Koelkast: vertraagt deterioratie

Optimale voorwaarden opzoeken parasieten in faeces Interferende substanties mbt detectie: 7 dagen wachten na gebruik van AB, barium, antimalaria middelen, minerale olie… Staalcollectie: goed sluitende container; minimaal enkele grammen faeces, om uitdroging te voorkomen ‘3-day-rule’: Faeces cultuur en parasieten extreem lage opbrengst, zo diarree ontstaan is na 3 dagen hospitalisatie, ook bij pediatrische populaties. In deze setting C. difficile opsporen. Overleg labo-kliniek zeer belangrijk in opstellen van ‘rejectiecriteria’: veilige grens van 5 dagen / ‘modified 3-day-rule’

Beschikbare methoden intestinale parasieten Macroscopische inspectie: consistentie, bloed, slijm… Microscopisch onderzoek: cysten en trofozoieten van amoeben, flagellaten en coccidia, wormeneieren en larven - de grootte (te meten met een micrometer) - het aspect van de kern - randen - RO verse faeces: opsporen trofozoieten (lage gevoeligheid; tijd !) - Concentratiemethoden: globale methoden: - flotatie (hoog SG: suiker, zinksulfaat) - sedimentatie (formaline-ether en derivaten laag SG) voordelen sedimentatie: minder technische fouten, eenvoudiger, grootste range detecteerbare organismen

Soortelijk gewicht S.G. of Zn-sulfate 33 %: 1.180 S.G. of formol-solution 10 %: 1.019 S.G. of ether: 0.714 S.G. of parasites: Ancylostoma 1.055; Giardia 1.060; Entamoeba histolytica (coli) and Endolimax nana 1.065 - 1.070; Ascaris 1.110; Trichuris 1.150, Chilomastix mesnili 1.180; Ascaris (unfertilized) 1.200 (Bailenger, 1965). M. Lontie

Microscopisch onderzoek: VS, Nederland : faeces in fixeermiddel (SAF, formaline, PVA…) permanente kleuring (trichroom, chromotrope kl…) Pro: - geschikt voor trofozoieten en cysten - herbekijken, expert advies mogelijk Contra: - expertise nodig EIA, DFA: monoclonale antistoffen tegen welbepaald species (Giardia, Cryptosporidium, Entamoeba histolytica) Pro: - verhoogde sensitiviteit, specificiteit en tijdswinst EIA giardiasis bijna even gevoelig als microscopie op 2 opeenvolgende stalen (Mank, 1997) Contra: -duur PCR: identificatie van Entamoeba species, detectie en identificatie Microsporidia – Blessmann (2002) E. histolytica real time PCR: significant gevoeliger dan microscopie, 100% specifiek

Triple Faeces Test (TFT) van Gool, 2003. 544 patiënten, 85% exacte inlevering 72% SAF preparaten: enkel met lugol conventionele methode: 22.9 % + TFT: 45.2 % + Intermittente shedding voordeel tgv - betere compliance - fixatief - permanente kleuring acceptabele meerkost

Triple Faeces Test (TFT) van Gool, 2003. Tabel van gool

‘Faeces parasieten’ in de praktijk: 2004 Microbiologisch faeces onderzoek: cultuur, C. difficile (cultuur en toxine), opsporen van parasieten; ook virologie ‘parasieten faeces’: - macroscopisch nazicht - microscopisch onderzoek na Ritchie-concentratie - auramine/safraninekleuring op vraag of bij MO verdacht voor Cryptosporidium Kostprijs voor labo ‘faeces parasieten’ 7.44 euro ‘Cryptosporidiumkleuring’ 8.40 euro In 2004 ‘parasieten faeces’ 1778 uitgevoerd; dalende trend tov vorige jaren (2327 in 2001 en 2002, 2111 in 2003)

Aanvragers van ‘faeces parasieten’ in 2004 vanaf 8 aanvragen / jaar weerhouden Grote aanvragers: E409 (29%), E302 (9.5%) en E595 (8%).

In 2004 werd 1778 keer ‘parasieten in faeces’ uitgevoerd In 2004 werd 1778 keer ‘parasieten in faeces’ uitgevoerd. Aanvragen per maand variëren tussen 125 en 183. Hoogste opbrengst in maanden april-juli (6.5-8.2%).

In 2004 werden 106 parasieten gedetecteerd, 86/1778 stalen waren positief (4.8%). Positieve stalen waren afkomstig van 67 patiënten. 36 parasieten evt pathogeen (E. dispar/histolytica) Gedetecteerde parasieten in 2004

Omgerekend naar patiënten: Giardia lamblia (18), Entamoeba histolytica/dispar (6), Taenia (2) en Cryptosporidium (1). In 2004 werden 1778 ‘parasieten faeces’ uitgevoerd, voor 27 patiënten werd een pathogene parasiet gedetecteerd. Gedetecteerde parasieten (1 isolaat / pt) in 2004

In het MCH in Leuven werd de analyse ‘parasieten faeces’ 4809 keer uitgevoerd in 2004, met een positief resultaat in 10.8% van de stalen. Frequentst gedetecteerd: Blastocystis hominis (273), Giardia lamblia (119) en Cryptosporidium (40). Blastocystis hominis goed voor 46 % van tot aantal parasieten Gedetecteerde parasieten (1 isolaat / pt) in 2004 - MCH

Blastocystis hominis Pathogeniciteit: controverse Onduidelijkheid over classificatie, levenscyclus, transmissie Komt wereldwijd voor Diagnose: cyste - achtige structuur in faeces; nogal labiel grootte sterk var (6 - 40 um) vers preparaat fixatie en permanente kleuring Heel frequent (81/ 247 in Nederland, T Mank, 1997)

Blastocystis hominis Gramkleuring Lugol Trichroom Ronde tot ovale cyste-achtige structuur met centrale vacuole, ring van cytoplasma met nuclei Grootte sterk variabel

‘Faeces parasieten’ in de praktijk: 2004 # positieve aanvragen (86) # pos. aanvragen / totaal aanvragen (% pos) # ptn met positief resultaat ( /67) E 409 52 52/497 (10%) 36 (53%) E 302 10 10/166 (6%) 8 (12%) E 595 7 7/139 (5%) 7 (10.5%)

Patiënten met een positief resultaat: hoeveel stalen beschikbaar ?

‘Faeces parasieten’ in de praktijk: 2004 Oktober en november samen: 267 analyses uitgevoerd 3.7 % analyses positief resultaat In 76% maar één staal voor handen In 9% van de aanvragen, patiënt langer dan 3 dagen gehospitaliseerd: geen parasieten gedetecteerd In 31.5 % combinatie van faeces cultuur, opzoeken C. difficile en parasieten. Bij kinderen ook in combinatie met detectie virussen ‘parasieten faeces’: - macroscopisch nazicht - microscopisch onderzoek na Ritchie-concentratie - auramine/safraninekleuring op vraag of bij MO verdacht voor Cryptosporidium Kostprijs voor labo ‘faeces parasieten’ 7.44 euro ‘Cryptosporidiumkleuring’ 8.40 euro In 2004 ‘parasieten faeces’ 1778 uitgevoerd; dalende trend tov vorige jaren (2327 in 2001 en 2002, 2111 in 2003)

‘Faeces parasieten’ in de toekomst Selectief + omstandigheden waaronder parasieten onderzoek niet optimaal zijn Faeces parasieten: - wel bij aanslepende diarree buiten het ZH (community-acquired, reizigers, immuungecompromitteerd) - niet bij diarree ontstaan na 3 dagen hospitalisatie: C. difficile - niet bij patiënten onder AB - samen met C. difficile: in zz gevallen - virologie kindjes: sneltesten afwachten – werken met apart staal voor virologie Klinische info nuttig:- reiziger, bestemming - immuungecompromitteerd - recent AB gebruik - recente hospitalisatie

‘Faeces parasieten’ in de toekomst Steeds Cryptosporidium kleuring: belangrijk voor immuungecompromitteerden, reizigers, kinderen in kribbes… Klinische verdenking amoebendysenterie en positief parasietenonderzoek: PCR ter differentiatie E. histolytica en niet-pathogene E. dispar kan ( ITG: om de twee weken, vers staal) Verdacht voor parasieten in faeces met een eerste negatief staal: tweede, evt derde staal van verschillende dagen. Verdenking voor Giardia: herhaalde microscopie, of antigentest (wordt geëvalueerd) TX-kandidaten: Strongyloides uitsluiten indien verblijf in risicogebied in voorgeschiedenis

‘Faeces parasieten’ TO DO Aanvraagformulier: - faeces parasieten (chronische diarree) Aanvraagformulier: - 4 extra velden bij ‘faeces parasieten’: reiziger immuuungedeprimeerd recent AB-gebruik hospitalisatie sinds … Contacteren van clinicus indien - ’5-day-rule’ overschreden - recent AB gebruik - parasieten samen met C. difficile - parasieten samen met virologie Steeds Cryptosporidium kleuring

‘Faeces parasieten’ TO DO Bij detectie van E. histolytica: rapporteren ‘E. histolytica / E. dispar’; indien gewenst, kan staal doorgestuurd worden voor PCR Bij negatief resultaat: ‘geen parasieten gevonden; Bij blijvende verdenking op een parasitaire infectie is herhaling van het onderzoek geïndiceerd’ ipv ‘negatief’ Chronische diarree bij kinderen: recipiënt met SAF ter beschikking stellen ter uitsluiting van D. fragilis? Nakijken TX protocols: Strongyloides stercoralis Opleiding/ kwaliteitscontrole uitvoering ‘faeces parasieten’? - externe QC - interne QC