Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te meten - bijv. insuline in bloed Berust op binding tussen antilichaam (Ab) en antigeen (Ag) 96 wells plaat: 8 rijen (A-H) en 12 kolommen (1-12)

Doel van ELISA experiment Het uitvoeren van een kwantitatieve immunologische bepaling Wat heb je hiervoor nodig? Gezuiverd antigeen. In deze practicumproef is dat humaan insuline (Ag) Een deel wordt gebruikt voor opwekken antilichamen Een deel (1 mg/ml) wordt gebruikt voor calibratie Een deel Ag wordt voorzien van biotine groep (AgB)

ELISA procedure Competitie tussen biotine gelabeld (AgB) en ongelabeld antigeen (Ag) Hoeveelheid gebonden AgB wordt bepaald met avidine-gelabeld HRP één putje van een 96-wells plaat

Uitvoering Allereerst moet het percentage werkzame IgG moleculen worden bepaald. Dit doe je door bij een variabele IgG concentratie (A-H) te bepalen wat de minimale hoeveelheid Ag (1-12) is waarbij alle AgB nog gebonden blijft.

Antilichaam aan putje binden Bereken de verdunning die je in moet vullen en noteer alle informatie!

Percentage werkzame antilichamen Coat IgG: Voeg 100 µl IgG (Ab) toe aan elk putje Maximale bindingscapaciteit van IgG per putje is 4 µg/ml, dus 100 µl x 4 µg/ml = 400 ng Niet gebonden antilichaam wegwassen Alle eiwit bindingsplaatsen bezetten/ blokkeren

Biotine-gelabeld antigeen (AgB) toevoegen Per putje 10 µl insuline (AgB), steeds dezelfde concentratie Maximaal 1 ng per putje zodat niet alle antilichamen zijn gebonden

Ongelabeld antigeen (Ag) toevoegen in elk putje 100 µl ongelabeld antigeen (Ag) in elke kolom een andere concentratie (12 kolommen) begin met overmaat (bijv. 100 ng) en verdun steeds met factor 2 Ongebonden antigeen wegwassen

Avidine-peroxidase toevoegen Avidine bindt zeer sterk aan biotine Peroxidase is een enzym Ongebonden avidine-peroxidase wegwassen

Substraat voor peroxidase toevoegen Peroxidase zet substraat om in kleurstof waarvan de absorptie gemeten kan worden

Stoppen kleurreactie

Absorptiewaarden voor kleurstof 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 IgG ng/well A 0,186 0,297 0,655 1,248 1,713 1,710 1,649 1,690 1,696 1,683 1,692 1,664 250,000 B 0,037 0,193 0,366 0,645 1,227 1,668 1,686 1,644 1,627 1,673 1,665 125,000 C 0,053 0,123 0,184 0,352 0,590 1,002 1,402 1,652 1,641 1,634 1,666 62,500 D 0,031 0,056 0,118 0,189 0,252 0,508 0,799 1,167 1,508 1,702 1,635 31,250 E 0,000 0,015 0,046 0,185 0,222 0,371 0,567 0,763 0,870 0,956 0,981 15,625 F 0,043 0,103 0,137 0,205 0,341 0,351 0,475 0,476 0,516 7,813 G 0,047 0,020 0,101 0,081 0,169 0,182 0,240 0,201 3,906 H 0,012 0,040 0,023 0,054 0,085 0,063 0,141 0,113 0,102 1,953 AgB (ng/well) 0,83 Ag (ng/well) 80,00 40,00 20,00 10,00 5,00 2,50 1,25 0,63 0,31 0,16 0,08 0,04 Ag + AgB (ng/well) 80,83 40,83 20,83 10,83 5,83 3,33 2,08 1,46 1,14 0,99 0,91 0,87 Daar waar de absorptie afneemt treedt competitie op! Reken uit hoeveel procent van het antilichaam aan het antigen heeft gebonden: (Ag+AgB)*15/(Ab)*100 %

Voorbeeld van een testcurve Neem daarna een nieuwe plaat voor het maken van een optimale calibratiecurve

Test voor een optimale calibratiecurve 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0,150 0,234 0,322 0,424 0,564 0,635 0,860 1,143 1,393 1,818 1,771 1,764 B 0,159 0,200 0,340 0,386 0,515 0,654 0,894 1,077 1,359 1,777 1,776 C 0,203 0,269 0,309 0,369 0,536 0,619 0,847 1,127 1,382 1,757 1,837 1,817 D 0,149 0,252 0,334 0,383 0,541 0,706 0,886 1,063 1,433 1,772 1,821 E 0,158 0,201 0,325 0,401 0,484 0,702 0,901 1,142 1,386 1,781 F 0,206 0,377 0,560 0,680 0,859 1,141 1,431 1,791 1,826 1,774 G 0,223 0,354 0,423 0,494 0,627 0,814 1,057 1,420 1,801 1,789 1,768 H 0,221 0,271 0,398 0,527 0,628 0,832 1,126 1,439 1,825 1,799 gem. 0,189 0,324 0,395 0,528 0,656 0,862 1,110 1,405 1,782 1,797 1,786 Ag + AgB (ng/well) 80,8 62,4 48,2 37,2 28,8 22,4 17,4 13,6 10,6 8,4 6,6 5,3 Ag (ng/well) 80,00 61,54 47,34 36,41 28,01 21,55 16,57 12,75 9,81 7,54 5,80 4,46 IgG ng/well dilution 250,0 1,0 AgB 0,83 Ag 80,0 1,3

Test voor de calibratiecurve

Ag concentratie in monster bepalen Concentratie Ab constant houden Kolom 1-6: calibratie Kolom 7-12: monster

Ag concentratie in monster bepalen Kolom 1-6: calibratiecurve Kolom 7-12: monster Ab concentratie constant

Ag concentratie in monster bepalen 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 0,293 0,371 0,517 0,650 0,925 1,192 0,366 0,428 0,590 0,695 0,904 1,189 B 0,313 0,374 0,560 0,674 0,879 1,161 0,301 0,391 0,589 0,729 0,923 1,205 C 0,319 0,410 0,561 0,742 0,872 1,132 0,368 0,382 0,571 0,698 0,886 1,180 D 0,358 0,430 0,587 0,732 0,873 1,118 0,355 0,386 0,572 0,690 0,867 1,170 E 0,331 0,457 0,565 0,676 0,857 1,211 0,363 0,380 0,537 0,723 1,197 F 0,285 0,450 0,704 0,934 0,287 0,376 0,515 0,728 0,947 1,116 G 0,346 0,531 0,877 1,193 0,274 0,440 0,558 0,700 0,868 1,176 H 0,325 0,444 0,559 0,677 0,942 1,174 0,370 0,415 0,495 0,680 1,140 gem. 0,321 0,424 0,555 0,697 0,895 1,172 0,336 0,400 0,553 0,705 0,891 Ag + AgB (ng/well) 80,8 62,4 48,2 37,2 28,8 22,4 Ag (ng/well) 80,00 61,54 47,34 36,41 28,01 21,55 Sample (ng/well) 800,00 615,38 473,37 364,13 280,10 215,46 IgG ng/well dilution 250,0 1,0 AgB 0,83 Ag 80,0 1,3 Sample 800,0

Optimale calibratiecurve

Monster curve

Berekening hoeveelheid insuline in monster Sample Y-value (absorbance) X-value (ng sample + 0.83 ng AgB) X-value calibration curve Ag in sample (ng) mg Ag / mL sample Getallen trendlijn a 25,626 0,891 280,1 29,3 28,5 1,017E-01 b -0,994 0,035 -3,359 3,379 y = 25,626x-0,994 Y/a ln (Y/a) ln (Y/a)/b e ^ (ln (Y/a) / b)

Opdrachten en verslag Opdrachten - Het bepalen van het percentage werkzame IgG moleculen in het gezuiverde IgG preparaat Vuistregels: zie kader blz. 15 - Testcurve en kwantitative analyse van het insuline monster Verslag - progress report! - het preparaat dat getest is - het percentage werkzame antilichamen - de testcurves en de curves van ijklijn en monsterverdunningen - de berekening van de concentratie insuline in het monster