De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Detectiemethoden Hybridisatie Blotten Probes maken Sequencen.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Detectiemethoden Hybridisatie Blotten Probes maken Sequencen."— Transcript van de presentatie:

1 Detectiemethoden Hybridisatie Blotten Probes maken Sequencen

2 Baseparing en hybridisatie Basenparing is de kern van heel veel biologische processen, en dus ook van onderzoekstechnieken. Door de temperatuur sterk te verhogen denatureert het DNA. Temperatuurverlaging geeft renaturatie. Er zijn andere methoden om dsDNA te denatureren: …… maar, verandering van de temperatuur wordt het meest gebruikt. Wanneer het gedenatureerde DNA heel snel wordt afgekoeld blijft het DNA enkelstrengs (bv. na 5’ 94°C direct in ijs plaatsen).

3 Denaturatie van ds DNA AT baseparen zijn minder sterk dan CG baseparen, vanwege het aantal H-bruggen. De temperatuur waarbij de helft van het DNA ss is, wordt de T m genoemd, de “melting temperature” (de smelttemperatuur).

4 De Tm waarde Waar hangt de T m van af??? – De base samenstelling van het DNA – De ionen (zout) concentratie van de DNA oplossing – De aanwezigheid van organische stoffen Als de ionen concentratie van de DNA oplossing toeneemt neemt ook de Tm toe. dsDNA wordt gestabiliseerd door kationen. Tweewaardige kationen (bv. Mg 2+ ) zijn effectiever dan eenwaardige kationen (K + ) Organische stoffen verzwakken de waterstofbruggen waardoor de T m lager wordt. Een voorbeeld is formamide.

5 Hoe bepaal je de T m van DNA??? Met de A260 waarde Door de A260 te meten van een DNA oplossing die geleidelijk wordt verwarmd kan de toename van het enkelstrengs DNA worden gemeten. Dit wordt een uitsmeltcurve genoemd..

6 De uitsmeltcurve is afhankelijk van de base samenstelling van het DNA. Voor DNAs met 30 – 70% GC geldt de volgende regel: GC% = 2,44 (T m – 69,3) Het uitsmelt effect wordt ook wel het hyperchroom effect genoemd. Tm berekenen: – Voor korte oligonucleotiden (oligo’s, tot 25 nt’s): T m =4*(G en C) + 2*(A en T)  C

7 10 °C onder de vastgestelde T m is alle DNA nog dsDNA 10 °C boven de vastgestelde T m is alle DNA ssDNA

8 Hybridisatie Wanneer bij de renaturatie ander ssDNA wordt toegevoegd kan dat ssDNA annealen met complementair DNA. Het maakt daarbij niet uit of het andere DNA dezelfde lengte heeft of niet. De techniek wordt hybridiseren genoemd!!!

9 Hybridisatie ssDNA kan ook hybridiseren met een stuk (je) RNA (i.p.v. met ssDNA) !! Heteroduplexen Homoduplexen Hybridisatie kan gebruikt worden voor de detectie van specifieke DNA fragmenten, klonen, genen mbv een Probe.

10 Hybridisatie mbv een probe Een probe is: – altijd enkelstrengs DNA of RNA – kan een oligonucleotide zijn maar kan ook veel langer zijn. – Een probe is altijd voorzien van een label, zodat je kan zien dat er hybridisatie heeft plaatsgevonden. Dat label is bv.: – Radio-activiteit 32 P, 35 S – Een Fluorescerende stof (FITC) – Een Enzym dat een kleuromzetting laat zien – Een Eiwit dat gedetecteerd kan worden door antilichamen (digoxigenine) De fluorescerende stof wordt geactiveerd met een emissie golflengte. De excitatiegolflengte, die je ziet heeft een hogere golflengte (minder energie).

11 Probe labelen

12 Kolonie-hybridisatie is een vorm van hybridiseren

13 Een andere vorm van hybridiseren is de “Southern blot methode” Blotten is het overbrengen van bv. DNA uit een gel (bv. Agarosegel) of poly-acrylamide) op een filter of membraan. – Southern blotten = overbrengen DNA – Northern blotten = RNA – Western blotten = overbrengen eiwit

14 De Southern blot techniek, gevolgd door hybridisatie met een probe Er zijn veel verschillende manieren om te blotten Hier wordt capillaire werking gebruikt.

15 Een andere manier van blotten is het electroblotten

16 Southern blots na hybridisatie In A is de agarose gel te zien die is gebruikt om te blotten. In B, C en D zijn verschillende probes gebruikt.

17 De Northern blot techniek gevolgd door hybridisatie De Northern blot techniek verschilt in principe niet van de Southern blot techniek. Het belangrijkste punt is dat het moeilijker is RNA te isoleren en intact te laten (RNA breekt veel makkelijker af dan DNA).

18 Op een Northern blot kun je kwantitatieve (hoeveelheid) eigenschappen meten maar ook kwalitatieve eigenschappen (lengte, splice - varianten). Northern Blot

19 Enkele voorbeelden van FISH Fluorescentie in situ hybridisatie

20 Sequencen Sequencen is het vaststellen van de nucleotiden volgorde van DNA. De meest gebruikte techniek is de dideoxy-methode die door Sanger is ontwikkeld in de jaren ’70 (Nobelprijs). Een andere naam is “chain-termination”- methode.

21 Sequencen Normaal nucleotide voor DNA = Dideoxy nucleotide

22 De synthese van de nieuwe DNA streng in aanwezigheid van ddGTP geeft bv. bovenstaand resultaat Dezelfde reactie wordt in aparte epjes uitgevoerd op hetzelfde DNA met ddATP, ddCTP en ddTTP

23 Electroforese na de sequentie-reactie Na de sequentiereacties worden de ds DNAs gedenatureerd en op een poly- acrylamide gel gescheiden.

24 Sequencen met fluorescerentie-labels In plaats van radio-actieve nucleotiden worden tegenwoordig fluorescerende labels gebruikt die aan de ddNTPs vastzitten. Alle 4 de sequentiereacties kunnen nu in 1 epje plaatsvinden en in 1 laan van een gel ge-electroforeerd worden = capillaire electroforese.

25 Rangschikken van clonen in een genomische bank Rangschikken mbv. STS = sequence-tagged site. Dit is een unieke sequentie van 200 – 500 bp (bv. een SSR = simple-sequence repetition) EST = expressed sequence tag Een sequentie van 500 – 800 bp van een gen dat tot expressie komt (Bv. van cDNA). In 2010 waren er 65,9 x 10 6 bekend. Een verzameling elkaar overlappende clonen is een contig die zijn gerangschikt mbv tags.

26 Genomics Als de sequentie bekend is kan er een heleboel worden opgezocht: – Waar liggen de genen – Repeterend DNA – Transposons – -……. – Alle sequenties zijn o.a. opgeslagen in de NCBI data bestanden (zie volgende dia).

27 Alle chromosomen en het MT DNA zijn bekend. Klik je op het MT DNA dan zie je de volgende dia.

28 Het MT DNA blijkt bp te zijn en voor een aantal genen te coderen.

29 Als je op het COX-2 gen klikt krijg je de volgende informatie.

30 Het Y-chromosoom. Er zijn 307 genen gevonden op het Y-chromosoom.

31 Het X-chromosoom. Er zijn 1336 genen op het X-chromosoom gevonden, waarvan 20 nog niet gelokaliseerd.


Download ppt "Detectiemethoden Hybridisatie Blotten Probes maken Sequencen."

Verwante presentaties


Ads door Google