De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven Deel 1.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven Deel 1."— Transcript van de presentatie:

1 basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven Deel 1

2 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

3 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

4 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-dubbelhelix

5 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-dubbelhelix 5’ TGA 3’ 3’ ACT 5’

6 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

7 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... 3 pijlers in de recombinant-DNA-technologie complementaire basenparing restrictie-enzym of restrictie-endonuclease DNA-polymerase

8 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... complementaire basenparing steeds: adenine – thymine (2 H-bruggen) guanine – cytosine (3 H-bruggen) van groot belang in biologische werking, o.a.: - DNA-replicatie - RNA-synthese cruciaal in vele technieken!

9 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... complementaire basenparing temperatuur absorbantie DENATURATIE ds DNA es DNA

10 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... complementaire basenparing temperatuur absorbantie TsTs

11 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... complementaire basenparing temperatuur absorbantie TsTs < T s GC-gehalte

12 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... complementaire basenparing temperatuur absorbantie RENATURATIE es DNA ds DNA

13 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... complementaire basenparing ook tussen niet perfect complementaire strengen is renaturatie (hybridisatie) mogelijk algemene regel: - smelttemperatuur van deze dubbelhelix lager naarmate aantal complementaire basen afneemt - hoe meer de strengen complementair aan elkaar, hoe hoger de temperatuur van het medium vóór denaturatie

14 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... restrictie-enzymen herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp) herkenningssequentie is palindroom 5’... GAATTC... 3’ 3’... CTTAAG... 5’

15 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... restrictie-enzymen... G AATTC CTTAA G... herkent en knipt welbepaalde sequentie van nucleotiden (4 tot 8 bp) herkenningssequentie is palindroom vaak met vorming “kleverige eindjes” 5’... GAATTC... 3’ 3’... CTTAAG... 5’

16 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-polymerase maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs steeds dubbelstrengs DNA nodig als start 3’... CTTAAG... 5’ 5’... GA 3’ steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde

17 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-polymerase maakt vanaf aparte nucleotiden DNA-streng aan op enkelstrengse matrijs steeds dubbelstrengs DNA nodig als start 3’... CTTAAG... 5’ 5’... GA 3’ ATTC... steeds aangroei nieuwe DNA-streng aan 3’-uiteinde

18 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

19 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) digestie van DNA met restrictie-enzym

20 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) digestie van DNA met restrictie-enzym

21 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) digestie van DNA met restrictie-enzym

22 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) digestie van DNA met restrictie-enzym gelelektroforese (met agarosegel)

23 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... gelelektroforese: opzet stalen 1 2 3

24 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... gelelektroforese: opzet stalen 1 2 3

25 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar gelelektroforese: spanning

26 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar gelelektroforese: spanning

27 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar gelelektroforese: spanning

28 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar gelelektroforese: visualisatie

29 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar gelelektroforese: visualisatie

30 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... restrictiefragment-lengtepolymorfisme (RFLP) digestie van DNA met restrictie-enzym gelelektroforese (met agarosegel) interpretatie

31 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... gelelektroforese: interpretatie

32 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... gelelektroforese: interpretatie 5’ … CAACTG … 3’ 3’ … GTTGAC … 5’ 5’ … CAATTG … 3’ 3’ … GTTAAC … 5’ 5’ … CAATT 3’ 3’ … G 5’ 5’ G … 3’ 3’ TTAAC … 5’

33 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... gelelektroforese: interpretatie

34 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... gelelektroforese: interpretatie 5’ … CGGTCTAGGTG … 3’ 3’ … GCCAGATCCAC … 5’ 5’ … CGGGGTG … 3’ 3’ … GCCCCAC … 5’ 5’ … CGGTCTAGGTG … 3’ 3’ … GCCAGATCCAC … 5’

35 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... gelelektroforese: interpretatie

36 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... gelelektroforese: interpretatie

37 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... resultaat na digestie van totaal genomisch DNA

38 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

39 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... Southern-vlektechniek nylondrager blotting autoradiogram + sonde radiografie 5’ … AACTCAGCTG … 3’ 5’ … AACTC 3’ 5’ AGCTG … 3’ 3’ GAGTCG 5’ agarosegel

40 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... Southern-vlektechniek: afkomst sonde (probe) uit gekende aminozuursequentie van eiwit (degeneratie code!) uit mRNA, na omzetting in cDNA sonde gebruikt in een ander, verwant organisme (voldoende complementair!)

41 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... DNA-dubbelhelix inleiding: 3 pijlers restrictiefragment-lengtepolymorfisme Southern-vlektechniek genkloning polymerase-kettingreactie DNA-sequentiebepaling basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie

42 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’ genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment lacZ-gen (enzym katalyseert omzetting “X-gal” naar blauwe kleurstof) ampicillineresistentiegen pUC18

43 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment 5’ GAATTC GAATTC 3’ 3’ CTTAAG CTTAAG 5’ 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’

44 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment 5’ GAATTC GAATTC 3’ 3’ CTTAAG CTTAAG 5’ GAATTC CTTAAG GAATTC CTTAAG 5’ GAATTC 3’ 3’ CTTAAG 5’

45 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment + ampicilline + X-gal bacterie – plasmide = niet-AB-resistent plasmide zonder donor-DNA = blauw

46 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment blotting radiografie

47 Vliebergh 2004DNA! Natuurlijk, maar... genkloning specifieke amplicatie van DNA-fragment


Download ppt "Basistechnieken van de recombinant-DNA-technologie door Peter Roels Monitoraat Wetenschappen K.U. Leuven Deel 1."

Verwante presentaties


Ads door Google