De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

H05IDB Marcel Lombaerts G3.052. IDB HC 9-12: Detectie en isolatie van nucleïne zuren Principles and Techniques of......(Wilson and Walker) 7th edition.

Verwante presentaties


Presentatie over: "H05IDB Marcel Lombaerts G3.052. IDB HC 9-12: Detectie en isolatie van nucleïne zuren Principles and Techniques of......(Wilson and Walker) 7th edition."— Transcript van de presentatie:

1 H05IDB Marcel Lombaerts G3.052

2 IDB HC 9-12: Detectie en isolatie van nucleïne zuren Principles and Techniques of......(Wilson and Walker) 7th edition –H5.1, 5.2, 5.6 t/m 5.7.2, 5.8 en 5.10 t/m –H10.2.1, en Biology (Campbell), 9th edition –H16.1 en H20.1 en 20.2 Biochemistry (Campbell and Farrel), 7th edition –H13.1, 13.2, 13.6 en 13.7

3 IDB HC 9-10: basis (+) nucleïnezuren I.Structuur van DNA and RNA II.DNA sequenties bij NCBI III.Zuiveren van DNA, RNA and mRNA IV.Restrictie enzymen V.Gel electrophoresis

4 I. Structuur van nucleotiden DNA en RNA zijn polymeren. Bouwstenen zijn nucleotiden.

5 Suikers

6 Stikstofbasen UU U

7 5’ en 3’ H2OH2O RNA!

8 Ketens U U

9 Baseparing G C A T T C T G A G A C

10 Baseparing G C A T

11 Opdracht

12 RNA is een polymeer van rNTPs

13 RNA is instabieler dan DNA RNA heeft OH groepen aan de C2 (2’), deze maken het molecuul gevoeliger voor hydrolyse DNA heeft geen 2'-OH is is daardoor stabieler Dat is logisch...

14 Verschillende typen RNA moleculen Messenger RNA (mRNA) –mRNA bevat de code van de te maken eiwitten –Complementair aan de coderende DNA sequentie Ribosomal RNA (rRNA) –Vormen de ribosomen (samen met enkele eiwitten) 3 typen in prokaryoten (5S, 16S, 23S) 4 typen in eukaryoten (5S, 5.8S, 18S, 25-28S) Transfer RNA (tRNA) –Transporteerd aminozuren naar de plek van eiwitsynthese (small RNA: snRNA, snoRNA, miRNA, siRNA, piRNA)

15 RNA Er zijn verschillende RNA’s mRNA: worden vertaald naar eiwitten rRNA: vormen de ribosomen die nodig zijn voor translatie tRNA: nodig voor het maken van eiwitten (gekoppeld aan aminozuren)

16 Voorbeeld tRNA RNA’s kunnen een intramoleculaire baseparing hebben (voornamelijk tRNA en rRNA)

17  Voorbeeld 16S rRNA

18 Lokatie in de cel DNA: constante factor (“genetic makeup”) RNA: verschillen per celtype, fase, omgeving enz. (“information flow”)

19 Verschillen tussen RNA en DNA RNA: 2’ OH group (ribose) Uracil binds Adenine (A,U,C,G) Multiple types and roles Often permanently modified via splicing Usually single-stranded Intramolecular binding DNA: 2’ H (deoxyribose) Thymine binds Adenine (A,T,C,G) One biological form Permanently modifications are rare (mutation) Double stranded Double helix structure

20 II. DNA sequenties: NCBI site

21

22 NCBI site

23 III. Isolatie en zuivering van nucleïnezuren Welk nucleïnezuur heb je nodig? (ssDNA, dsDNA, RNA, mRNA) Welk organisme? (menselijke cellen, lagere eukaryoten, planten, prokaryoten, virussen, enz.) Uitgangs materiaal? (heel orgaan, cel culture, bloed enz.) Wat ga je ermee doen? (PCR, cloneren, labellen, RT-PCR, cDNA synthesis, enz.)

24 Methode (algemeen) isolatie nucleïnezuren Cellen openbreken Nucleïnezuren scheiden van de rest (eiwitten en membranen) Nucleïnezuren isoleren

25 DNA isolatie fenol chloroform (1) Homogeniseren weefsel, lysis, proteinase K Eerst fenol en daarna fenol : chloroform : isoamylalcohol (25:24:1) Centrifugatie

26 DNA isolatie fenol chloroform (2) Precipitatie (neerslaan) - isopropanol, (soms KAc en) ethanol (eindconcentratie 70%) of ammoniumacetaat - incuberen: -20 °C tot 4 o C Afdraaien Wassen met ethanol 70-75% bij KT/ 4 o C

27 DNA isolatie fenol chloroform (3) Drogen - “aan de lucht” - bij 37, 50, 60 o C -“speedvac” DNA oplossen in 10 mM Tris 1mM EDTA (T 10 E 1 ) pH 7,4 - 7,6 Oplossen RNA in RNase vrij H 2 O (soms TE)

28 Waarom? Cellen wassen? Wat zit er in lysisbuffer? ProtK stap? Fenol? Wassen met 70% EtOH? Waarom drogen? TRIS in de buffer? EDTA in DNA buffers? Vaak geen EDTA in RNA oplosbuffers?

29 Andere methoden… fenol/chloroform extractie en ethanol precipitatie silica membraan kolommen anion exchange resins (ionenwisselaars) magnetische beads

30 DNA isolatie: silica membraan - Homogeniseren (lyseren, met zout) - Centrifugeren -Elueren (laag- zout) Roche, Fermentas

31 Opdracht Een analist gebruikt de silica membraan methode voor het isoleren van DNA uit cellen. Na het lyseren en het verwijderen van het celdebris brengt hij het sample met veel opgelost zout op de silica kolom. Vervolgens draait hij af en verwijdert de flow-thru. Hierna wast hij de kolom met water (flow-thru wordt weer verwijderd) waarna het DNA geëlueerd wordt met een laag zout buffer. Na meting op de NanoDrop blijkt dat er geen DNA aanwezig is in het sample. Leg uit wat de oorzaak hiervan is.

32 Anion-exchange resin Homogeniseren –lyseren, zonder zout Centrifugeren Elueren (pH en zout concentratie) Qiagen kits

33 Elutie anionen wisselaar kolom

34 Opdracht

35 Magnetic particles/beads - Homogeniseren met balletjes (silica coated) - Magnetiseren - Wassen - Elueren (losmaken van de balletjes) EZ1 Biorobot, Qiagen Magnapure, Roche Kingfisher Cobas Ampliprep

36 Overzicht

37

38 RNA isolatie Erg vergelijkbaar met DNA isolatie (phenol chloroform procedure) In de cel zit veel meer RNA dan DNA RNA isolatie: meestal totaal RNA (rRNA, mRNA, en in mindere mate tRNA) mRNA (poly A + RNA) ≈ 1-5% van het totale RNA

39 mRNA isolatie 1-5% van het totaal RNA in eukaryoten is mRNA het merendeel is rRNA TTTTTTT Oligo (dT)25 bead Poly (dT) bead genexpressie onderzoek

40 Werken met RNA RNase!!!! 1)Bewaar RNA bij (-20°C of) -80°C, werk op ijs 2)Draag handschoenen 3)Gebruik DEPC-treated water om oplossingen te maken 4)Voeg eventueel RNase inhibitors toe 5)Gebruik RNase vrije epjes en puntjes 6)Andere materialen: hitte (180 ºC gedurende enkele uren), wassen met DEPC water, NaOH of H 2 O 2 7)Maak een aparte RNA ruimte? RNA lab

41 DNA / RNA DNA / RNA hoeveelheid & kwaliteit

42 DNA / RNA concentratie bepalen [DNA] of [RNA]: absorptie of emissie (fluorescentie) Absorptie x nm Licht (x nm golflengte) Emissie  fluorescentie y nm excitatie Licht (x nm golflengte)

43 DNA / RNA concentratie bepalen (absorptie) Absorptie x nm Licht (x nm golflengte) I. Concentratie DNA & RNA met UV-VIS spectrofotometer (absorptie)

44 DNA / RNA concentratie bepalen (absorptie) I. Concentratie DNA & RNA met UV-VIS spectrofotometer (absorptie) 1) Meet de A 260 nm (OD 260 ) A 260 =1 dan 50  g/ml DNA of 40  g/ml RNA concentratie DNA in  g / ml = 50 * absorptie DNA bij 260 nm concentratie RNA in  g / ml = 40 * absorptie RNA bij 260 nm 2) Meet bij 280 nm = eiwitten Bepaal de 260 / 280 ratio:DNA: A 260/280 =1,8 RNA: A 260/280 =2,0 (pH7,5) In de praktijk: tussen 1.6 en 2.0 liggen – (redelijk) eiwitvrij DNA / RNA

45 Opdracht 5  l van een DNA oplossing wordt doorgemeten in een eindvolume van 1 ml, de OD 260 = 0,213. Cuvetlengte is 1 cm Wat is de concentratie van deze DNA oplossing?

46 DNA / RNA concentratie Nanodrop UV-VIS spectrofotometer Rekent zelf de concentratie en A260/280 verhouding uit

47 DNA / RNA concentratie bepalen (fluorescentie) II. Concentratie DNA & RNA d.m.v. fluorescentie Emissie  fluorescentie y nm excitatie Licht (x nm golflengte)

48 DNA / RNA concentratie Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen Picogreen toevoegen aan dsDNA  fluorescentie

49 DNA / RNA concentratie Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen 1 Maak een ijklijn 2 Sample waarvan je de concentratie wilt weten 375 ng / ml

50 DNA / RNA concentratie Concentratie DNA m.b.v. fluorescentie  Picogreen

51 DNA / RNA concentratie Fluorescentie (Picogreen) vs UV-VIS PicogreenUV-VIS meet dsDNAmeet dsDNA, nucleotiden, RNA geen contaminanteninterferentie door contaminanten sensitiefminder sensitief (A260 van 0.1 = 5 ug/ ml DNA)

52 DNA / RNA kwaliteit biotrek.rdrake.org/img/gallery/ 33electrophore Agilent Bioanalyzer Gel electroforese

53 DNA / RNA kwaliteit DNA kwaliteit

54 DNA / RNA kwaliteit RNA kwaliteit 2:1 1 : 2 RIN waarde (RNA Interety Number)

55 IV. Restrictie enzymen (H5.6 Wilson & Walker 7 th ) Enzymen die DNA aan specifieke sequenties (meestal palindromen) kunnen binden en de suiker-fosfaatketen kunnen verbreken (endo-nuclease) Betrokken bij afbraak “vreemd DNA” Vele geïdentificeerd (500+) Best bekend: type II restrictie enzymen Vele zijn commercieel verkrijgbaar

56 Restrictie enzymen (H5.6 Wilson & Walker 7 th ) Voorbeeld: EcoRI: herkent een 6 base-pair palindromische sequentie 5’---GAATTC---3’ 3’---CTTAAG---5’ 5’---G AATTC---3’ 3’---CTTAA G---5’ ---GAATTC---

57 Restrictie enzymen (H5.6 Wilson & Walker 7 th )

58 Blunt Sticky

59 Roche: SuRE/Cut buffers

60 Gel running V. Agarose gel electroforese Agarose gel scheid DNA fragments o.b.v. grootte Kleine fragmenten gaan sneller door de gel Buffer: bv TBE of TAE

61 DNA gel electrophorese Moleculair weight markers = DNA fragmenten met bekende grootte Loading buffer EtBr/Sybr Safe 0.4-2% agarose gel Gel buffer/running buffer

62 Agarose gel electrophorese DNA “kleuren”: EtBr Let op: is carcinogeen! SyBr Safe

63 DNA Gel Electrophoresis

64 Zijn de volgende opmerkingen juist of onjuist? Een hoog percentage agarose gel (2%) is geschikt om twee PCR fragmenten van 7000 bp en 7500 bp van elkaar te scheiden De pH van de buffer heeft invloed op de migratie van DNA door de gel Je zou i.p.v. TBE buffer ook 0,9% NaCl kunnen gebruiken voor de electroforese DNA migreert in een agarose-gel van de kathode (-) naar de anode (+)

65


Download ppt "H05IDB Marcel Lombaerts G3.052. IDB HC 9-12: Detectie en isolatie van nucleïne zuren Principles and Techniques of......(Wilson and Walker) 7th edition."

Verwante presentaties


Ads door Google