De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Eiwitten in het nieuws. Adenosine-receptor o tekentafel.51851.lynkx tekentafel.51851.lynkx.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Eiwitten in het nieuws. Adenosine-receptor o tekentafel.51851.lynkx tekentafel.51851.lynkx."— Transcript van de presentatie:

1 Eiwitten in het nieuws

2 Adenosine-receptor o tekentafel lynkx tekentafel lynkx o /many.receptor.models.used.drug.design.may.not.be.useful.after.all /many.receptor.models.used.drug.design.may.not.be.useful.after.all o Nu 3D-structuur van drie receptoren van de 800 die we hebben… o Belangrijk voor medicijnonderzoek (Parkinson, ….)

3 Green Fluorescent Protein o Nobelprijs Scheikunde 2008 o groen-eiwit lynkx groen-eiwit lynkx o mistry/laureates/2008/ mistry/laureates/2008/ o

4

5 Studietaak 3 Post-translationele modificaties Signals in sequences

6 oEiwitten: meer dan alleen aminozuren oPost-translationele modificaties o‘Signaal’ hiervoor in az-volgorde! oVoorspellingen over de structuur en/of functie van eiwitten oOp basis van die signalen

7 Post-translationele modificaties

8 oAanpassingen na afloop van (= ‘post’) translatie oExtra ‘groepen’ die aan eiwitten worden gezet oInvloed op o.m. vorm en functie van het eiwit oKen je zelf voorbeelden? oProteolytische klieving oProtein sorting / protein targeting (pre-sequenties) oVan inactief pro-eiwit naar actief eiwit (pro-sequenties)

9 Signaaltransductie

10 EPO: geglycosileerd eiwit

11 Afsplitsing van aminozuren of peptiden

12 o Gebeurt door proteolytische enzymen o Specifiek (herkenningssequentie)

13 Trypsine activeert andere zymogenen o Trypsine is de algemene activator van alle pancreatische zymogenen (pro-enzymen)

14

15 o Elk organisme bezit proteolytische enzymen o Er zijn verschillende klasses proteolytische enzymen (ter info, niet kennen!) o Allerlei functies o Elk protease/proteïnase/peptidase heeft zijn eigen substraatspecificiteit = herkenningsplaats & klievingsplaats: alleen bepaalde aminozuurvolgordes! (straks meer)

16 Activatie van proteases o Een aantal proteases is betrokken bij het activeren van pro-eiwitten (zoals pro-insuline) o Maar proteases worden zelf ook meestal gesynthetiseerd als pro-eiwitten o Op de plaats van bestemming (bv. buiten de cel bij een bacterie of in het darmlumen bij de prancreatische proteases) wordt het pro-gedeelte afgesplitst (meestal door weer een ander protease) en wordt het protease actief

17 Proteolytische enzymen in het biochemisch onderzoek 1: Bepaling van de aminozuursequentie van een eiwit

18 o Bepaling van aminozuursequentie gebeurt tegenwoordig in 99,9% van de gevallen via DNA-technologie (HOE?), maar vroeger kon dat niet….

19 oPehr Edman ontwikkelde een methode voor het labelen van de N-terminus van een peptide, gevolgd door klieving ervan van het peptide oDeze methode heet Edman-degradatie oDoor dit achter elkaar te doen en elke keer het gelabelde en vervolgens afgekliefde aminozuur te identificeren (mbv HPLC) kan de aminozuursequentie van peptiden tot ca. 50 az worden bepaald Ouderwetse bepaling van de az-sequentie

20

21 oEen tweede manier is om vanaf de C-terminus steeds een aminozuur af te klieven m.b.v. carboxypeptidase en dit steeds te identificeren Ouderwetse bepaling van de az-sequentie

22 o Langere polypeptides moeten eerst in kleinere stukjes worden ´gehakt´ m.b.v. proteases of cyanogeenbromide (CNBr) o Bijvoorbeeld: EnzymKlievingsplaats TrypsineLys of Arg (C) ChymotrypsinePhe, Trp, Tyr (C) PepsinePhe, Trp, Tyr (N) CyanogenbromideMet (C) Ouderwetse bepaling van de az-sequentie

23 o Behandeling van een polypeptide met trypsine Sub-peptides Polypeptide

24 NC Trypsine (lys, arg) Chymotrypsine (trp, tyr, phe) De az-volgorde van de sub-peptides is onbekend! De sequentie wordt gereconstrueerd d.m.b. de overlap tussen op verschillende manieren geproduceerde sub-peptides (1) (2) Az-volgordes bepalen van de geproduceerde peptides 

25 Oefenen oIk heb een klein peptide van negen az oNa incubatie van dit peptide met trypsine (R K) vind ik twee peptides met de volgende az-volgordes: oAAWGK oTYVK oNa incubatie van hetzelfde peptide met chymotrypsine (Y W F) vind ik een peptide met de volgende az-volgorde: oVKAAW oDe overige brokstukken cq losse az van de incubatie met chymotrypsine zijn te klein om te isoleren en deze zijn dus niet bepaald! oWat is de az-volgorde van dit peptide?

26 Nog meer oefenen o

27 Protein Targeting

28 Bij prokaryoten zijn er niet zoveel verschillende locaties om een eiwit naar toe te sturen Welke? Eukaryote cellen hebben organellen en dus veel meer locaties om eiwitten naar toe te sturen

29 Prokaryoten: bekendste systeem: Sec-systeem

30 Twee ‘soorten’ ribosomen: Vrije ribosomen: maken eiwitten die in het cytosol zitten Aan ER gebonden ribosomen (‘ruw ER’) maken eiwitten voor endomembraansysteem (  organellen) en eiwitten die uitgescheiden worden Aan kernmembraan gebonden ribosomen maken eiwitten die in celkern terecht moeten komen Eiwitten voor endomembraansysteem of buitenkant: na synthese van N-terminaal signaalpeptide binding aan SRP (= signal- recognition particle) SRP met peptide en ribosoom aan SRP receptor op het ER; verwijdering van signaalpeptide Protein Targeting bij eukaryoten

31 Na koppeling ribosoom aan ER gaat synthese verder en eiwit komt in lumen ER terecht Daar blijft het of het wordt verder getransporteerd Zo zijn er ook signaalsequenties (‘postcodes’) voor mito’s, chloro’s, kern en andere organellen die geen deel uit maken van het endomembraan-systeem Hierbij wordt het eiwit eerst helemaal gemaakt in het cytosol en vervolgens naar het organel geïmporteerd Protein Targeting bij eukaryoten

32 nce/protein_targeting.html

33

34

35

36

37 Signaalsequenties o De ‘postcodes’ van de cel o Meer op

38 Extra groepen aan eiwitten

39

40 Glycosylering Acylering Myristoylering Methylering Fosforylering Sulfering Prenylering Hydroxylering Amidering Carboxylering …..

41 Glycosylering

42 . Een glycoproteïne is een eiwit met daaraan covalent gebonden een of meer koolhydraat-moleculen (ook wel glycanen genoemd). Het kan hierbij gaan om monosacharide(s), disacharide(s), oligosacharide(s), polysacharide(s) of afgeleiden hiervan (bv. sulfo- of fosfo- gesubstitueerd). Het kan gaan om één, enkele of veel koolhydraten per eiwit.

43 De meeste modificaties bij glycoproteïnen vinden plaats via N- of O- glycosidische bindingen O-linkage: Ser, Thr (GalNAc)N-linkage: Asn (GlcNAc) o ~ 50% van alle eukaryote eiwitten is geglycosyleerd o Hiervan is 90% N- linked glycanen o Het vaakst worden de volgende monomere suikers aangetroffen: glucose, galactose, mannose, fucose, GalNAc en GlcNAc

44 o Eiwit-glycosylering vindt plaats tijdens het transport in ER en Golgi o Dus alleen eiwitten die via deze route gaan worden geglycosyleerd! (waar kun je dus geglycosyleerde eiwitten verwachten en waar niet??) o De glycosylering is belangrijk voor de vouwing en de functie van het eiwit

45

46 Cutis laxa: Een van de aandoeningen die het gevolg zijn van een glycosyleringsdefectglycosyleringsdefect

47 Hoe toon je aan of er bij een patiënt sprake is van een glycosyleringsdefect? o N-glycosylering: Isoëlektrische Focusering (IEF) van transferrine o Transferrine in bloed o Geglycosyleerd eiwit o Afwezigheid of verstoring glycosylering a.g.v. algemeen glycsoyleringsdefect leidt tot afwijkend Isoëlektrisch Punt (IEP) van transferrine oSinds kort ook een klinische test voor O- glycosyleringsdefecten dankzij oud-studente Suzan Wopereis

48

49 Voorspellingen Meer in de computerles

50 Voorspellingen oVoorspellingen over de structuur en/of functie van eiwitten gebaseerd op: oVergelijken van eiwitten oDe aminozuurvolgorde van het eiwit zelf o Signalen in aminozuursequenties

51 Voorspellende methodes o Van isoëlektrisch punt, via secundaire structuur en glycosyleringssites tot sorteersignalen o Veel van deze methodes zijn te vinden bij het Expert Protein Analyis System o Demo´s in computerles

52 Pas op! Voorspelling!!! Bijvoorbeeld N-glycosylering (N-X- (S,T)): Programma ziet alle mogelijke N- glycosyleringssites Dit betekent NIET dat deze ook daadwerkelijk allemaal geglycosyleerd zijn Dat laatste kun je alleen in het lab aantonen


Download ppt "Eiwitten in het nieuws. Adenosine-receptor o tekentafel.51851.lynkx tekentafel.51851.lynkx."

Verwante presentaties


Ads door Google