De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie De Smet.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie De Smet."— Transcript van de presentatie:

1 Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie De Smet Mr. Wim Goeteyn Laboratorium voor Medische Biochemie en Klinische Analyse

2 Overzicht  Doel  Algemene richtlijnen  Technieken  Uit te voeren proeven

3 Doel = bepaling van endogene componenten in een biologische matrix... Bloed Urine Punctievocht Etc. Serum / Plasma Complicatie: vele andere, gelijkaardige componenten aanwezig dikwijls in veel  conc.  nood aan SELECTIVITEIT SENSITIVITEIT …om pathologische toestanden op te sporen en/of te bevestigen

4 Bloed Afname met anticoagulans  GEEN STOLLING Afname zonder anticoagulans  STOLLING uitzakking of centrifugatie RBC, WBC PLASMA Prop: cellulair materiaal stollingsEW SERUM: helder supernatans

5 Anticoagulans  = antistollingsmiddel  wordt toegevoegd aan proefbuis voor bloedafname Voorbeelden: NaF NaCitraat EDTA Heparine F - inhibeert de enzymatische activiteit Complexatie Ca 2+ Prothrombine thrombine

6 Bepaling van… targetcomponent  een targetcomponent creatinine, bilirubine, ureum, cholesterol... enzymactiviteit  een enzymactiviteit Alkalische fosfatase, LDH, …

7 Bepaling van een targetcomponent Algemene strategie  Monster: ontdooien  mengen !  Deproteïniseren: = hogere structuren van proteïnen H 2 SO 4, TCA, EtOH  Centrifugeren

8  Supernatans: = bovenstaande vloeistof moet steeds HELDER zijn! SpectrofotometrieFluorimetrie - na chemische kleurreactie bilirubine, glucose colorimetrisch Phenylalanine - na enzymatische omzetting glucose enzymatisch

9 Bepaling van een enzymactiviteit   bepaling van targetcomponent  uitvoering op speciale spectrofotometers  rekening houden met chemische structuur  Michaëlis-Menten !!!!  meestal kinetische bepaling - overmaat substraat toevoegen - hoev. substraat afgebroken / tijdseenheid of hoev. product gevormd / tijdseenheid  spectrofotometrisch volgen - enzymactiviteit berekenen

10 Reactie- snelheid Conc. Substraat 0 de orde : 0 de orde : overmaat substraat bepalen van enzymactiviteit 1 ste orde : 1 ste orde : overmaat enzyme bepalen van substraat (targetcomponent)

11 Algemene Richtlijnen Stalen  1 plasmastaal  1 plasmastaal (  9 mL)  gedurende volledig practicum bewaren  onmiddellijk na gebruik in de ijskast  niet in de zon laten staan  zilverpapier rond staal: zelf meebrengen (bilirubine breekt af o.i.v. licht) !! steeds HOMOGENISEREN: omzwenken niet schudden

12 1 bloedstaal  1 bloedstaal  hematologie STEEDS op de dag zelf ter beschikking gesteld Opmerking: Handschoenen!

13 Materiaal Materiaal  Plastiek box materiaal lijst controleren bij begin practicum  Chronometers  Knikkers  Knikkers Zelf meebrengen  Zilverpapier  Spectrofotometers steeds aangeduid toestel gebruiken ALLEEN plastieken cuvetten gebruiken voorspoelen cuvetten voorspoelen

14 Centrifuges Centrifuges  STEEDS symmetrisch vullen Indien nodig: Indien nodig: evenwicht door toevoegen van een buis water  STEEDS centrifugeerbuizen merken!       =   = 

15 Reagentia  Standaarden:  meestal 1 per groep  correcte concentratie gebruiken in de berekening  nooit voorspoelen met standaardoplossingen  contaminatie vermijden!  ijskast!  Producten aan weegschaal:  droog houden: deksels op potten!!  Vloeibare reagentia:  flessen afsluiten met juiste stoppen  contaminatie!  Kits:  Kits: zuinig zijn!! (LDH en glucose enzymatisch slechts 1x uitvoeren)

16 Verslagen Geen papieren verslagen meer Resultaten in SI-units (zie omrekeningstabel, bijlage 2) Resultaten in computer ingeven, LOGIN en PASWOORD worden samen met staal geleverd.

17 Algemeen - Milieu - Veiligheid  Proper werken - ‘s Avonds opruimen (trekkasten, microscopen!)  GEEN jassen, GEEN boekentassen  LABOJAS verplicht  VEILIGHEIDSBRIL  NIET met de mond pipetteren (peer)  MILIEU!!! GEEN reagentia in wasbakken (ook niet vanuit cuvetten), enkel in afvalvaten

18 Voorbereiding:  Dagelijks ondervraging mogelijk  Zowel schriftelijk als mondeling  Geen examenproef, dus GOED WERKEN  Resultaat practicum telt voor 25% mee in het eindresultaat van het opleidingsonderdeel Medische Biochemie !!!!

19 Technieken  Spectrofotometrie

20 I0I0 Spectrofotometrie Lichtstraal van bepaalde energie ( E  1/ ) die door een oplossing wordt gestuurd zal met de moleculen van die oplossing interactie vertonen.  De buitenste electronen van de moleculen worden door de EMS naar een hogere energietoestand gebracht.  Intensiteit lichtstraal daalt. Intensiteit Afstand I dIdIdIdI

21 - dI  I 0 met  N * via mathematische afleiding: Wet van Lambert-Beer I 0 E = log = . M. l I E = extinctie  = molaire extinctiecoëfficiënt M = molariteit v/d oplossing l = weglengte I 0 = oorspronkelijke intensiteit N * = # absorberende deeltjes / cm 2 doorsnede

22 Spectrofotometer Spectrofotometer: schematisch - onderdelen - onderdelen1. lichtbron (UV, of zichtbaar) 2. golflengteselector 3. cuvet (glas,plastiek of quartz) 4. intensiteitsmeter (fotogevoelige cel) - meestal 2 schaaluitdrukkingen: T en E E = log 1 / T I0I0 I detector

23 Doel = Concentratiemetingen Doel = Concentratiemetingen 1. met 1 bekende en een onbekende: 1-puntscalibratie E x  C x E x C x = E st  C st E st C st 2. met reeks bekenden en onbekende: ijklijn  C x = E x. C st E st E4E3E2E1E4E3E2E1 ExEx C 1 C 2 C 3 C 4 CxCx y = ax + b

24 Proeven  Medische achtergrond  Praktische aspecten

25 HEMATOLOGIE RBC RBC of erythrocyten:  Aantal WBC WBC of leucocyten:  Aantal  Leucocytaire formule

26 RBC Polycythemie Anemie # RBC en/of Hb  # RBC en/of Hb  Overmatig bloedverlies Hemolytische anemie Defecte bloedaanmaak Fysiologisch: bewoners hooggebergte of hoogtestage  O 2 -gebrek  EPO  Pathologisch: t.g.v. beenmerg- of niertumor

27 WBC Onmisbare rol in het afweermechanisme Pathologie: Leucopenie Leucocytose # WBC  Differentiatie  leucocytaire formule Vb. # granulocyten < 1000/ µL  infectiegevaar 

28 Praktisch VOLBLOED: de dag zelf ter beschikking Tellen RBC:  Telkamer van Bürker: 2 kamers per draagglas  Hayemopl.: bevat HgCl 2 (GIFTIG) Leucocytaire formule:  Geen dekglaasje, maar een dr. immersie-olie Microscopen:  Lenzen ev. schoonmaken met xylol  Voorwerpglaasje NIET raken met lens

29 UREUM Degradatie van ANZ  afsplitsing  -NH 2 -groep  trans- of de-aminatie-reactie Elk metaboliserend weefsel produceert NH 4 +  toxisch Ureum- of ornithinecyclus Omzetting NH 4 + -ionen tot ureum in lever Minder toxisch Gemakkelijke eliminatie langs nier Uremie  nierfunctie testen N-bevattende eindprodukten  urine

30 Praktisch Proefbuizen afsluiten met knikker  bediende TIMING!!!

31 BILIRUBINE Hb (MW: 64450):  Tetrameer = 4 HEEM groepen + 4 GLOBINE ketens  Drager van O 2 Biodegradatie Hb (lever):  Splitsing in heem en globine  Proteïnedeel  proteïne-catabolisme  Heem  bilirubine  glucuronidatie (gal)  darm: faeces urine

32 Geelzucht of icterus Hyperbilirubinemie: opstapeling bilirubine t.g.v. levercelbeschadiging obstructie van de galafvoer Praktisch Bilirubine: lichtgevoelig  zilverpapier Enkel totaal bilirubine wordt bepaald Diazo II en diazoreagens: zelf maken Ijklijn: zie p. 37

33 CREATININE Creatine: glycine + arginine + methionine belangrijke spierconstituent Fosfocreatine:° spieren in rust ogenblikkelijke E-leverancier voor spiercontracties cycliseert spontaan tot creatinine Creatinine: nutteloos afvalprodukt uitscheiding door nier Creatininemie  o.a. nierinsufficiëntie

34 Praktisch Creatinine stockstandaard :  frigo  nog verdunnen MIN. 1u incuberen Alk. picraatreagens vlak voor gebruik bereiden Natriumtungstaat = natriumwolframaat

35 ELEKTROFORESE %-samenstelling van de EW  Albumine  Diverse globulines (o.a.  -globulines  immunologische reflex)  afwijking: indicatie pathologie Scheiding: gebaseerd op differentiële migratie van geladen EW in een elektrisch veld (zie ook item in Webcourse) Praktisch Let op: elektroforesekamer in werking  220V reagens om strips op te lossen is sterk zuur  peer

36 GLUCOSE De onmiddellijke E-bron bij uitstek voor de cellen bij overmaat:start glucose consumptie glycogenese, glycolyse, lipogenese bij tekort: start glucose productie gycogenolyse, gluconeogenese, interconversie insuline + glucagon dirigenten: insuline + glucagon Diabetes Mellitus of suikerziekte: basisdefect:  insuline biochemisch: hyperglycemie glycosurie ketogenese en acidose  klinische symptomen

37 Hexokinasemethode: meest specifieke methode glucose enzymatisch hexokinase glucoseglucose-6-P ATPADP G-6-fofaat-DH glucose-6-P + NADP + 6-fosfogluconaat + NADPH + H + NADPH  spectrofotometrisch van NADP + * Slechts 1 X per student * TIMING * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans Bepalingen

38 Colorimetrische methode: Somogyi-Nelson glucose colorimetrisch  van eiwitten kleurvorming gebaseerd op reducerende eigenschappen * arsenomolybdaat-reagens: giftig, gebruik dispenser * [glu] > 500 mg/dL: opnieuw met 1/2 verdunning van supernatans

39 ENZYMACTIVITEITSBEPALINGEN Frequent uitgevoerd in het klinisch labo Soorten plasma-enzymen: Plasma-specifieke Plasma-specifieke Niet-specifieke Niet-specifieke = enzymen van cellulair metabolisme conc plasma > conc cellen specifieke functie aanmaak in lever conc plasma  bij leverdeficiëntie specifieke voor weefsel of orgaan conc plasma  bij celbeschadeging vb. ADH in levercellen

40 Alkalische fosfatase (ALP) Opsporing van o.a. lever- en botafwijkingen p-nitrophenylfosfaat p-nitrophenol Absorbtie van p-nitrophenol bij 405 nm WWB 30°C Opletten: bij 37° C denatureert ALP! Praktisch Niet te lang!

41


Download ppt "Praktische Oefeningen MEDISCHE BIOCHEMIE Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Prof. Dr. J. Van Bocxlaer Apr. Ruben t’ Kindt Apr. Michael Storme Apr. Julie De Smet."

Verwante presentaties


Ads door Google