De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

 Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:

Verwante presentaties


Presentatie over: " Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:"— Transcript van de presentatie:

1

2  Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk: cysteine)  Hoe kunnen we elkaar vinden  Vragen

3  Gespecialiseerd laboratorium op het terrein van de erfelijke stofwisselingsziekten (metabole ziekten)  Ca. 170 fte, waarvan de ~50% in de diagnostiek  8 stafleden, waarvan 2 in de metabolieten diagnostiek (lichaamsvloeistoffen)  Ca nieuwe patiënten / jaar

4

5

6

7 1.Lysosoom 2.Celmembraan 3.Mitochondrion 4.Endoplasmatisch reticulum 5.Cytoplasma 6.Kernmembraan 7.Kernporie 8.Kern 9.Kernlichaampje 10.Ribosoom 11.Golgi-systeem.

8  Ontdekt in 1949 door Christian de Duve  De stofzuigers van de cel  Afbraak van allerlei celcomponenten (vetten, eiwitten, complexe suikers, erfelijk materiaal)  Afbraakproducten gaan naar cel plasma  Zuur milieu (zuurtegraad (pH): ~5); cel: ~7.2

9  Cysteine: HOOC HC-CH 2 -SH ( ) NH 2  Cystine: HOOC COOH HC-CH 2 -S-S-CH 2 -CH ( ) NH 2 NH 2  Cysteamine: NH 2 -CH 2 -CH 2 -SH( ) COOH  Cysteamine-cysteine disulfide: NH 2 -CH 2 -CH 2 -S-S-CH 2 -CH ( ) NH 2

10 cystine Lysosoom Cysteine-transporter Lysine-transporter De cel Cystine-transporter

11 cystine Lysosoom Cysteine-transporter Lysine-transporter De cel Cystine-transporter cystine

12 Lysosoom Cysteine-transporter Lysine-transporter De cel Cystine-transporter cystine

13 cysteamine cysteine Lysosoom Cysteine-transporter Lysine-transporter De cel Cystìne-transporter

14  Cystine stapelt in lysosoom tgv het transporter defect  Cystine is (fors) verhoogd in m.n. de granulocyt (= witte bloedcel waarin veel lysosomen zitten)  Cystine is ook verhoogd in gekweekte huidfibroblasten  DNA diagnostiek van het Cystinosine gen (17p13)

15

16  Isolatie granulocyten uit bloed ◦ Vermijden contaminatie met andere bloedcellen (mn rode)  Vermijden artificiële vorming van cystine uit cysteine ◦ Oxidatie van cysteine geeft cystine ◦ Rode- en witte bloedcellen bevatten veel cysteine

17 (polymorphonucleaire cellen)

18  Met behulp van dextraan (complex suiker molecuul) worden de bloedcellen gescheiden  Aan buis bloed wordt dextraan toegevoegd, incubatie 1 uur op ijs.

19 Leukocyten (witte cellen) Erythrocyten (rode cellen)

20 Neutrofiele granulo Eosinofiele granulo Basofiele granulo LymfocytMonocyt 35-75%0-5%0-2%15-40%0-6% Totaal: x 10 9 per liter granulocyten

21 Leukocyten (witte cellen) Erythrocyten (rode cellen)

22  Het leukocyten isolaat wordt behandeld met Ficoll (= complexe suiker).  Ficoll wordt onder leukocyt suspensie gepipetteerd (géén menging lagen)  Centrifugatie, 20 min, 4°C, 500g (1800 rpm)  Scheiding op soortelijk gewicht

23

24 lymfocyten granulocyten Echter nog wel mét rode bloedcellen erbij

25

26  Rode bloedcellen nemen makkelijk water op uit hun omgeving  Plaats rode bloedcellen in een “waterige omgeving” en ze zullen opzwellen en barsten  + 3 mL ijskoude MilliQ (= zuiver labwater)

27  De geïsoleerde granulocyten worden 3 x gewassen met fysiologisch zout (PBS).  Tussendoor: centrifugeren 10 min, 4°C, 500g  Afzuigen wasbuffer en invriezen in vloeibare stikstof (-196°C)  Opslag in -80°C vriezer tot analyse

28

29

30 De cel Lysosoom cysteine Andere –SH verbindingen cystine HOOC HC-CH 2 -SH NH 2

31

32 Door “oxidatie” krijgen we foutief verhoogd cystine uit 2 moleculen cysteine Vals verhoogd cystine

33  N-ethylmaleimide (NEM) Het NEM reageert met –SH verbindingen (o.a cysteine)

34 + NEM Het NEM bindt aan alle –SH groepen en vangt daarmee ook het aanwezige cysteine weg Het bindt NIET aan cystine in overmaat

35 Cystine ( ) is moeilijk te meten. Cysteine ( ) is makkelijk te meten!

36

37  In het isolaat zit nog cystine (moeilijk meetbaar) en verder het cysteine-NEM en andere SH-NEM stoffen.  De overmaat aan NEM is weggevangen en kan géén cysteine meer binden  Na wegvangen overmaat NEM kunnen we cystine “breken” tot 2 x cysteine en dit meten.  Er wordt een ‘kleurstof’ specifiek voor cysteine toegevoegd

38 Gekleurd cysteine te meten met fluorescentiedetector

39  HPLC: High Performance Liquid Chromatography (hogedruk vloeistof chromatografie)  Chromatografie: het scheiden van een mengsel van stoffen op basis van hun eigenschappen

40

41

42

43

44

45  Om de hoeveelheid te kunnen bepalen wordt een zogenaamde ijklijn opgenomen.  Bekende concentraties cysteine worden geanalyseerd en piekoppervlakten worden gemeten

46 Diverse bekende (!) concentraties cysteine in tweevoud bepaald op de HPLC. Computer berekent het piekoppervlak.

47 Hoeveelheid cysteine Oppervlakte piek In patiëntenmonsters wordt het piekoppervlak van de cysteine piek bepaald en met behulp van de ijklijn wordt cysteine concentratie bepaald. Stel: piekopp is ; dan is de bijbehorende cysteine concentratie: µM

48  Oppervlak ~ Concentratie cysteine  Cysteine is afkomstig van cystine (= ½ cystine)  Cysteine concentratie wordt gehalveerd.  Hoeveelheid eiwit (in mg) is een maat voor de hoeveelheid geïsoleerde cellen.  Uitslag is xx nmol cystine / mg eiwit.

49  In gezonde personen: < 0.17 nmol/mg (in granulo’s)  Targetwaarde: lager dan de range zoals gezien wordt bij “obligaat dragers” (dwz ouders van patiënten) Cystinosis is een autosomaal recessief ziektebeeld: Ouders zijn drager maar hebben géén klachten.

50  Kinderpoli:  Volwassenen:  Kinderpoli:  Meetweek Nijmegen: week 4 (ma 24-01)   Kinderpoli:  Volwassenen:  Kinderpoli:  Meetweek Nijmegen: week 17 (ma 25-04)   Kinderpoli:  Kinderpoli:  Volwassenen:  Meetweek Nijmegen: week 26 (ma 27-06)   Volwassenen:   Kinderpoli:  Kinderpoli:  Meetweek Nijmegen: week 43 (ma 24-10)

51  In de 3 weken voorafgaand aan de Nijmeegse meetweek kunnen op maandag én woensdag bloedmonsters worden ingestuurd naar Nijmegen voor granulocyt isolatie in Nijmegen.  Samples dienen te worden aangekondigd en moeten voor 12 uur in het lab zijn (ivm langdurige opwerking)  Monsters worden dan in de eerstvolgende meetsessie meegenomen.

52  Veel stappen in de opwerking van de bloedmonsters tot een uitslag in nmol cystine/mg eiwit  Complexe diagnostiek met veel ‘pitfalls’  Graag bereid met u van gedachte te wisselen hoe we de dienstverlening nog beter kunnen afstemmen op uw wensen.

53 Analisten: Dinny van Oppenraaij-Emmerzaal Jenneke Keizer-Garritsen Gwendolyn Beckmann Louk Geelen “Het Oude Team” Addy de Graaf-Hess Henk Blom Elena Levtchenko Marjolein Bos

54

55 European Research Network Inherited Disorders of Metabolism


Download ppt " Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten  (Klein beetje) biochemie  Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten  Meting cystine (eigenlijk:"

Verwante presentaties


Ads door Google