Eiwitzuivering 3 Kolom chromatografie: - Gelfiltratie - ionchromatografie - affiniteitschromatografie TBEMH-P05IDB HC7 Sigrid Beiboer en Ivo Horn

Kolom chromatografie Verschillende soorten

Een systeem

Een systeem

Chromatogram

Een kolom Mobiele fase Stationaire fase biochemistry.wur.nl/Hb/Gelfiltratie.html

Scheiding op een kolom

Gedrag van moleculen in een kolom Ideaal: verdeling lineair adsorptie: meer neiging tot binding aan stationaire fase adsorptie CS desorptie: minder neiging tot binding aan stationaire fase desorptie CM Cs= concentratie is stationaire fase Cm= concentratie in mobiele fase

Isothermen en piekvorm een juist evenwicht tussen stationaire fase en mobiele fase geeft een scherpe piek. toenemende hoeveelheid massa piekpatroon in chromatogram Cs Cm Cs Cm desorptie Cs Cm adsorptie

K K is de verdelingscoëfficiënt: waar bevindt zich een molecuul in de kolom, in CS of in CM geeft de mate van verdeling over matrix en mobiele fase weer Wet van Nernst: K = Cs/Cm CS CM K = CS/CM

De “zone”; de piek De zone is het oppervlak van de piek De zone is rechtevenredig met de concentratie

Kolom chromatografie Verschillende soorten

Gelfiltratie Gelpermeatie of uitsluitingschromatografie (size exclusion chromatography) Kleine moleculen hebben meer tijd nodig

De matrix voor gelfiltratie Goede elutie eigenschappen Hydrofiel karakter Geen geladen groepen Chemische resistentie Biologische resistentie Bijv. polymeren van: acrylamide (Biogel P) dextraan (Sephadex) combinatie acrylamide en dextraan (Sephacryl) agarose (Sepharose, Biogel A)

De volumina in een kolom Vc = kolom volume V0 = void volume (buitenvolume) Vi = intern volume (binnenvolume) Vm= matrix volume Ve= elutie volume Vm Vc = V0 + Vi + Vm groot eiwit: Ve=V0 klein eiwit: Ve=V0+Vi

Berekeningen met gelfiltratie Vc = V0 + Vi + Vm = kolomvolume = π r2 h, hieruit de benodigde hoogte Kd of K0 = (Ve - V0) / Vi ; (Cs/CM), verdeling over kolom K0: hoe groter de K0, hoe kleiner de molmassa (Mw): K0 nadert 0: groot molecuul. K nadert 1: kleinste moleculen (volledige distributie over Vi en V0)

Toepassingen gelfiltratie Isolatie en zuivering biomoleculen (H05PBM) Molecuulmassa bepaling Ontzouten Bufferverwisseling

Vraagje Welke van onderstaande methoden kun je gebruiken om zout te verwijderen? Gelfiltratie Ultrafiltratie Dialyse Homogeniseren Centrifugeren

Fractieverzamelaar Meet OD280 en geeft dit door aan recorder Verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en geeft buiswisseling ook door aan recorder

Zuivering mbv gelfiltratie

Zuivering mbv gelfiltratie

Ionchromatografie Ionenwisselaars R-Na2 + Ca2+ R-Ca + 2Na+ Zeolieten: - natuurlijke ionenwisselaars - aluminiumsilicaten

Principe scheiding

Matrix en spacer arms  Matrix: - onoplosbaar - chemische resistent - biologische resistent - inert - capaciteit Spacer arm vaak voor biochemische toepassingen tegengaan sterische hindering  Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

Ionogene groepen Kationenwisselaar: - bevat negatief geladen / zure groepen (bv. Dowex-50, CM cellulose, Chelex-100) - uitwisseling positieve kationen Anionenwisselaar: - bevat positief geladen / basische groepen (bv. Dowex-1, DEAE) - uitwisseling negatieve anionen

Toepassingen voor water Ontharding van water: kalk, Ca2+ Na+ Demineralisering van water: - verwijdering kat- en anionen - 2 ionenwisselaars (indien gemengd: mixed bed) - kationen worden vervangen door protonen - anionen worden vervangen door OH--ionen Op lab: demiwater, gedemineraliseerd water mbv hars kolom, vergelijkbaar met enkelvoudig gedestilleerd water mQ of milliQ water, gedemineraliseerd water mbv Millipore kolom, soort “bidest”

Toepassingen voor eiwitten Eiwitlading pH hoog pH laag pH neutraal Neutrale a.z. 0 0 0 Basische a.z. 0 + n+ Zure a.z. - 0 m- Netto lading - + n-m Isoëlektrisch punt (IEP): pH waarbij de nettolading van het eiwit nul is kan bepaald worden met isoëlektrische focussering

Hoe werkt ionchromatografie bij eiwitzuivering? pH boven IEP, eiwit is negatief anionenwisselaar pH beneden IEP, eiwit is positief kationenwisselaar pH en ionsterkte bepalen affiniteit eiwit voor kolom Grotere afwijking pH van IEP grotere affiniteit

Elutie pH wijzigen of ionsterkte verhogen [NaCl]=0 [NaCl]=1 M Buffer en pH blijven gelijk in zoutgradiënt, alleen zoutconcentratie stijgt!

Ionchromatografie van aminozuren Al in eerder IDB college van Wd gehad

Zuivering mbv ionchromatografie

Affiniteitschromatografie Zuivering gebaseerd op biologische functie of individuele structuur

Scheidingsprocedure

Affiniteit De mate van aantrekking van moleculen reversibel, dus niet covalent! 

Affiniteitschromatografie Mobiele fase Stationaire fase Schone uitloop

Schema affiniteitschromatografie

 Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

Matrix Inert Open structuur toegankelijk voor eiwitten om aan ligand aan matrix te kunnen binden Groot aantal chemische groepen, waaraan ligand covalent gekoppeld kan worden Goede elutie eigenschappen Chemische stabiliteit

Voorbeelden matrix Agarosekorrels Polyacrylamide korrels Poreuze glazen korrels Grote bolvormige korrels: geven interkorrel ruimtes, die geschikt zijn voor AC van grote biomoleculen zoals ribosomen, membraanfracties en zelfs intacte cellen!

Ligand Specifieke, reversibele affiniteit voor biomolecuul Bezit minstens één reactieve groep voor binding aan matrix mag niet betrokken zijn bij biologische herkenning! Oplosbaar in vloeistoffen betrokken bij koppelingsproces en bestand tegen koppelingsreacties Bindingsaffiniteit voor biomolecuul: niet te sterk niet te zwak aanwezig na koppeling aan matrix

Spacer arms  Tegen sterische hindering Fysisch-chemische eigenschappen van spacer arms beïnvloeden karakter matrix en affiniteit van biomolecuul voor ligand Hydrofobe spacer arms: toename aspecifieke binding Tegengaan door klein beetje organisch oplosmiddel in eluens of hydrofiele spacer arm  Matrix Spacer arm Ligand Biomolecuul

Voorbeelden spacer arms

Niet selectieve elutie Verandering van: pH Ionsterkte Pas op voor denaturatie biomolecuul!!

AC voor IgG-antilichamen IgG antilichamen zuiveren met Protein-A, -G of -L affiniteitschromatografie

Biotine Hoge affiniteit voor streptavidine en avidine Eiwitten zijn makkelijk te biotinyleren

Biotine gebruikt om het ligand aan de matrix te koppelen

Zuivering biotine-bindende eiwitten Nadeel van biotine elutie hier is, dat je eiwit niet volledig zuiver is. Er zit immers nog biotine aan.

Immobilized Metal Affinity Chromatography (IMAC) Zuivering van recombinant histidine gemerkte (His-tagged) eiwitten Histidine: pK is 6,5 heeft imidazole ring

IMAC Interactie tussen twee naburige His-aminozuren in de 6xHis-tag en de Ni-NTA-matrix.

Rode staartjes = His-tag 6 histidine aminozuren IMAC Elution Buffer: 20 mM Tris-HCl (pH 8.0), 250 mM NaCl, 300 mM imidazole, 0.05 % Tween 20, 0.02 % NaN3 Imidazole lijkt op histidine en competeert de histag van de kolom Zuiveringsprocedure op Ni-NTA-Spin kolommetjes.

IMAC

Zuivering van GST-fusie eiwitten Glutathione-S-Transferase