Immunohistochemische kleuring op Benchmark XT (Ventana) versus Bond-Max (Leica) Student: Sieglinde Pattyn Stagementor: Dr. N. De Wever Stagebegeleider: Mevr. K. van oostveldt Stageplaats: AZ sint-augustinus veurne Academiejaar 2014-2015 Howest Brugge: Medisch laboratoriumtechnologie

Inhoudstafel Onderzoeksvraag Toestellen Methode Resultaten Besluit Benchmark XT (Ventana) Bond-Max (Leica) Methode Validatie Tijdsmetingen Resultaten Tijden Kleuringen Besluit

1. Onderzoeksvraag Hoeveel tijd vragen beide toestellen van de laborant? Benchmark XT (Ventana) Bond-Max (Leica)

2. Toestel: Benchmark XT (Ventana) Glaasjescaroussel ThermoPad Liquid Coverslip 100µl Stabiele waterige omgeving en voorkomt verdamping Computer met software, labelprinter, staining module, AFS-module en afvalvatmodule Liquid coverslip

2. Toestel: Bond-Max (Leica) Covertile Processing module 3 glaasjestray (10/tray) + apart verwarmingselement 4 reagentiatray (30) Mixstation Controller (software) Robotarm ID-imager Aspiratingprobe Labelprinter Bulkcontainers  afvalvat schadelijk afval  kostprijs afvalverwerking drukken Covertile : capillaire kracht 100µl of 150µl Antilichaam volume 100µl of 150µl

3. Methode Validatie 11 antilichamen Positief controlemateriaal Start: Protocol aangewezen door firma Leica Aanpassen: Geconcentreerd antilichaam Verdunning Incubatietijd Buffer Ready-to-use antilichaam Antilichaam andere firma Tijd meten van elke uitgevoerde stap voor beide toestellen Klinische stalen (zelfde voor beide toestellen) Drie runs

4. Resultaat: Werktijd van de laborant Verschil 4-9minuten Bulkvloeistoffen: Reactiebuffer en afvalvat Dispensers Covertiles Niet meegerekend: Starten toestel Volumebepaling in containers Bond-Max Wasprogramma Benchmark XT

4. Resultaat: Runtijd Theoretisch (30 glaasjes) Benchmark 3-4u Bond-Max 2u-3u30min 30min -1u Praktisch (3runs) 44min -1u OPM: Bond-Max: 2e/3e tray  tijden reeds gestarte tray verlengt want zelfde robotarm

4. Resultaten: Totale tijd Meer dan 1u Reden: Wasprogramma 15min Opstarttijd bond-max zeer <

4. Resultaat: Kleuringen Plaats Benchmark XT (Ventana) Bond-Max (Leica) Opmerking Anti-P16 Kern & Cytoplasma Achtergrondkleuring, aanpassing antigenretrieval Anti-Ki-67 Kern Optimaal P16  cervix KI-67  slokdarm

4. Resultaat: Kleuringen Plaats Benchmark XT (Ventana) Bond-Max (Leica) Opmerking Anti-CDX2 Kern Optimaal CDX2  slokdarm

4. Resultaat: Kleuringen Plaats Opmerking Anti-P504S Cytoplasma Verdere validatie noodzakelijk Anti-34βe12 Achtergrondkleuring, aanpassing antigenretrieval Anti-P53 Kern Anti-HP Spiraalvormige bacterie Controleweefsel te hoog gelegen, werd niet gekleurd. Sommige resultaten worden hierdoor verworpen. Kleuring wel goed. P504s , 34Be12  Prostaat P53  slokdarm HP  Maagmucosa

5. Besluit Onderzoeksvraag: Hoeveel tijd vragen beide toestellen van de laborant? Werktijd: Benchmark XT > Bond-Max Runtijd: Benchmark XT > Bond-Max Totale tijd: Benchmark XT > Bond-Max Indien een optimale validatie voorafgaat aan het klinisch gebruik, kan de tijd nodig van de laborant gereduceerd worden met het gebruik van Bond-Max (Leica).

Bedankt voor uw aandacht! Benchmark XT (Ventana) Bond-Max (Leica)

Immunohistochemie: Principe Antigen Eiwit op oppervlak cel of intracellulair Aan- of afwezigheid wijst op ziekte Antilichaam of immunoglobulinen Eiwit door organisme geproduceerd als reactie op antigen Monoklonaal = affiniteit voor slechts één type epitoop van antigen Polyklonaal = affiniteit voor meerdere epitopen van antigen

IHC: Maken van Polyklonale antilichamen Polyklonaal = Antiserum met een variëteit aan immuunglobulines die kunnen binden op hetzelfde antigen met verschillende specifieke antistoffen die elk binden op één specifieke epitoop. Productie Dier inspuiten met antigen Stimulatie immuunrespons  productie antilichamen tegen antigen Antilichamen isoleren uit serum. Ag verschillende epitopen  productie van verschillende Al tegen de verschillende epitopen

IHC: Maken van Monoklonale antilichamen Hybridoomtechnologie Immunisatie = Inspuiten antigen in proefdier Isolatie plasmacellen uit milt Plasmacel produceert antilichamen Onsterfelijk maken van plasmacel Celfusie met myelomacel  Delen ongeremd In polyethyleenglycol Selecteren in HAT-medium Hypoxanthine en Thymidine  Bouwstenen DNA en RNA Aminopterine  Inhibitie normale syntheseweg DNA en RNA voor myelomacellen Niet-gefusioneerde plasmacellen sterven van ouderdom Resultaat = Hybridoma’s Produceren Verdunning  één cel per putje + groeimedium Selectie van klonen die gewenste antilichaam produceren Inspuiten Ag  herhaling na 6-12 weken  3 dagen later milt eruit Fusieproces Tumorcellen (= myelomacellen) delen ongeremd  goed te kweken Fusie in PEG (polyethyleenglycol)  nabijgelegen membranen smelten samen Selectie HAT-medium om niet-gefuseerde myeloomcellen verwijderen Hypoxanthine en Thymidine = Bouwstenen voor DNA en RNA Aminopterine = Inhibitor voor normale syntheseweg (novo-synthese pathway) van DNA en RNA. De hybridoma’s gebruiken dankzij B-cellen een alternatieve pathway Niet-gefusioneerde B-cellen sterven na 1-2 weken van ouderdom Cellen na 3 weken = Celklonen of hybridoma’s Productie Verdunnen over microtiterplaat  1 cel per putje + groeimedium Elk puntje bevat dan cellen die één type antistof produceren tegen één epitoop Monoklonaal serum Klonen die gewenste Al produceren worden geselecteerd (geven reactie met gekozen Ag.

Immunohistochemie: Principe Detectiemethoden Directe methode Indirecte methoden Polymeermethode Multimeermethode Nadeel directe methode Verminderde affiniteit voor antigen door covalente bidning van enzym/fluorochroom op Al  Sensitiviteit daalt Polymeermethode Secundaire Al en enzymen op één dextraan ruggengraat  tijdswinst Nadeel: Sensitiviteit en specificiteit negatief beïnvloed Multimeermethode Normaal enzymatische indirecte methode Enzym via spacer op Al Kleine structuur  makkelijk door weefsel migreren (detectie van lagere conc. Ag)  Goede sensitiviteit Goede specificiteit BRAB = Bridged avidin biotine Affiniteit van eiwit avidine/streptavidine voor vitamine biotine (bindt met Al als enzym) LSAB: IgG – Biotine – Avidine – biotine – PO ABC-techniek: verschillende biotine per enzym (croslink tussen verschillende avidine-biotine-enzym-complexen) *

Antigenretrieval Fixatie Antigenretrieval Stilleggen chemische processen Formaldehyde Crosslinks met macromoleculen: Aminozuren en eiwitten Nadeel: Verlies van immunologische herkenning Proteïnen binden met elkaar  structuurverandering Antigenretrieval HIER = Heat induced epitope retrieval EIER = Enzyme induced epitope retrieval

Validatie Punchen = maken van positief controleweefsel Geconcentreerd antilichaam Bepalen optimale antilichaamtiter en antigenretrieval Testen met optimale verdunning (ev. Verdunningsreeks)  Bepalen optimale titer Testen van verschillende antigenretrieval technieken  Bepalen optimale antigenretrieval Testen van reeks van positief/negatief weefsel tot adequate specificiteit en sensitiviteit is bekomen Ready-to-use antilichaam Zie stap 3 & 4 vorige Kleuringen in duplo uitvoeren op beide toestellen  Vergelijken Dagelijkse controle Intern positief controleweefsel

Resultaat: Kleuringen validatie Melan-A (20x) Ki-67 (10x) HP (40x)

Anti-P16 Link Roche pRB bindt aan transcriptiefactor E2F  geen transcriptie van genen die celcyclus en proliferatie stimuleren Normale celcyclus: E2F komt vrij van pRB  stimulatie celcyclus, mitose en activatie van p16 gen (wat leidt tot p16 productie) P16-eiwit vergemakkelijkt de herbinding van pRB met E2F  stop van celcyclus HPV infecteerd basale cellen van het epithelium meeste van de HPV-infecties zijn transient en gaan voorbij in 6-12 maanden  ze kunnen leiden tot verhoogde celproliferatie maar verstoren de balans tussen pRB en E2F niet of verstoren niet de controle van P16-expressie Sommige persisteren en produceren virale E6 en E7 oncoproteïnen  zorgen voor oncogenen transformaties door de celregulatiemechanisme te verstoren E7 zal de werking van pRB schaden door de binding met E2F tegen te gaan  ongereguleerde celproliferatie, genetische instabiliteit en p16 overexpressie (DETECTEERBAAR met IHC)