Optimalisatie van enzymatische testen voor de analyse van sulfiet, L-ascorbinezuur en glucose in voedsel Kürt Bultinck Biotox, Jabbeke

Overzicht Principe Principe Analyses Analyses Bepalingen Bepalingen Resultaten Resultaten Conclusies Conclusies Sulfiet L-ascorbinezuur of vitamine C Glucose

Principe Reproduceerbaarheid Reproduceerbaarheid Herhaalbaarheid Herhaalbaarheid Juistheid van de controle Juistheid van de controle Juistheid van het spiken Juistheid van het spiken Opstellen van een validatiedossier gebeurt aan de hand van:

Analyses 3 bepalingen met 3 verschillende matrices: Sulfiet (rotsjes, sinaasappelsap en koekjes) L-ascorbinezuur of vitamine C (pannenkoeken, sinaas- appelsap en poeder afkomstig van vitamine C- supplementen. Glucose (pannenkoeken, sinaasappelsap en confituur)

Bepalingen Pipetteer in een cuvet Blanco (mL) Staal (mL) Reactiemengsel 2* 1,0001,000 Staal-0,100 Demiwater2,0001,900 Oplossing 3 0,0100,010 Meng en lees de absorbanties af na ongeveer 5 minuten. Start de reactie na toevoeging van: Oplossing 4 0,0500,050 Meng en lees de absorbantie af na 30 minuten. Sulfiet

Bepalingen Pipetteer in een cuvet Blanco (mL) Staal (mL) Oplossing 1 (37°C) 1,0001,000 Staal0,1000,100 Demiwater1,5001,500 Spatel met ascorbaatoxidase één spatel - Meng en incubeer gedurende 6 minuten bij 37°C. Roer om de 2 minuten 5 seconden met de spatel. Lees de absorbanties af en start de reactie door toevoegen van: Oplossing 3 0,1000,100 Meng en plaats de cuvetten bij 37°C. Lees de absorbantie af na 15 minuten. Vitamine C

Bepalingen Pipetteer in een cuvet Blanco (mL) Staal (mL) Oplossing 1 1,0001,000 Staal-0,100 Demiwater2,0001,900 Meng en lees de absorbantie af na 3 minuten (A1). Start de reactie na toevoeging van: Oplossing 2 0,0200,020 Meng en lees de absorbantie af na 15 minuten. Glucose

Resultaten Sulfiet Vitamine C Rotsjes (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Koekjes (mg/kg) Gemiddelde450,014750,78 Standaarddeviatie7,110,00217,14 % variatiecoëfficiënt 15,7914,2214,06 Reproduceerbaarheid Pannenkoeken (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Poeder (mg/kg) Gemiddelde2704,30, ,9 Standaarddeviatie275,90, ,8 % variatiecoëfficiënt 10,2013,554,05

Resultaten Glucose Glucose Reproduceerbaarheid Pannenkoeken (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) confituur (mg/kg) Gemiddelde13727,832, ,3 Standaarddeviatie5282,680,036855,02 % variatiecoëfficiënt 38,481,152,92

Resultaten Sulfiet Vitamine C Rotsjes (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Koekjes (mg/kg) Gemiddelde41,83330,013361,5 Standaarddeviatie7,170,00174,416 % variatiecoëfficiënt 17,1313,197,18 Herhaalbaarheid Pannenkoeken (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Poeder (mg/kg) Gemiddelde2416,80, ,3 Standaarddeviatie338,770,011400,7 % variatiecoëfficiënt 14,026,114,70

Resultaten Glucose Herhaalbaarheid Pannenkoeken (mg/kg) Sinaasappelsap (g/L) Confituur (mg/kg) Gemiddelde13727,832, ,3 Standaarddeviatie5282,680,036855,02 % variatiecoëfficiënt 38,481,152,92

Resultaten Sulfiet Juistheid controle Theoretisch sulfietgehalte Gemeten sulfietgehalte % terugvinding Meting 1.1 0,30,29799,00 Meting 1.2 0,30,29899,33 Meting 1.3 0,30,303101,00 Meting 1.4 0,30,29899,33 Meting 1.5 0,30,29799,00 Meting 1.6 0,30,29498,00 Gemiddelde99,28

Resultaten Vitamine C Juistheid controle Theoretisch vitamine C- gehalte Gemeten vitamine C- gehalte % terugvinding Meting 1.1 0,20,158179,05 Meting 1.2 0,20,163281,60 Meting 1.3 0,20,160480,20 Meting 1.4 0,20,158179,05 Meting 1.5 0,20,159579,75 Meting 1.6 0,20,162481,20 Gemiddelde80,14

Resultaten Glucose Juistheid controle Theoretisch glucosegehalte Gemeten glucosegehalte % terugvinding Meting 1.1 0,50,494998,98 Meting 1.2 0,50,494998,98 Meting 1.3 0,50,493198,62 Meting 1.4 0,50,495799,14 Meting 1.5 0,50, ,18 Meting 1.6 0,50,492398,46 Gemiddelde99,06

Resultaten Sulfiet % terugvinding Rotsjes 1 114,03 Rotsjes 2 101,50 Gemiddelde107,77 Standaarddeviatie8,86 Koekjes 1 91,87 Koekjes 2 103,86 Gemiddelde97,87 Standaarddeviatie8,48 Terugvinding spiken Vitamine C % terugvinding Poeder 1 87,30 Poeder 2 81,97 Gemiddelde84,64 Standaarddeviatie3,77

Resultaten Glucose Terugvinding spiken % terugvinding Confituur 1 14,69 Confituur 2 17,82 Gemiddelde16,26 Standaarddeviatie2,22

Conclusies Sulfiet Reproduceerbaarheid: Te hoog, niet ok. Herhaalbaarheid: Te hoog, niet ok. Juistheid controle: Ok. Terugvinding spiken: Ok. Vitamine C Reproduceerbaarheid: Te hoog, niet ok. Herhaalbaarheid: Te hoog, niet ok, behalve poeder. Juistheid controle: Te laag, niet ok. Terugvinding spiken: Te laag, niet ok.

Conclusies Glucose Reproduceerbaarheid: Te hoog, niet ok. Herhaalbaarheid: Enkel sinaasappelsap ligt te hoog, voor sinaasappelsap en confituur is het ok. Juistheid controle: Ok. Terugvinding spiken: Te laag, niet ok. Externe bepaling: 1,45%  hier 1,40%  Ok.

Optimalisatie van enzymatische testen voor de analyse van sulfiet, L-ascorbinezuur en glucose in voedsel Kürt Bultinck Biotox, Jabbeke

Bestanddelen Sulfiet -Oplossing 1: triethanolaminebuffer; -tabletten NADH; -Oplossing 3: NADH-peroxidase; -Oplossing 4: sulfietoxidase. L-ascorbinezuur -Oplossing 1: Natriumfosfaat/citraatbuffer en MTT; -Ascorbaatoxidase spatels; -Oplossing 3: PMS-oplossing

Bestanddelen Glucose Glucose - Oplossing 1: mengsel van triethanolaminebuffer, NADP, ATP en magnesiumsulfaat; - Oplossing 1: mengsel van triethanolaminebuffer, NADP, ATP en magnesiumsulfaat; - Oplossing 2: mengsel van hexokinase en glucose-6-fosfaat dehydrogenase.

Wet van Lambert-Beer A=a.b.c A= absorbantie (geen éénheid)A= absorbantie (geen éénheid) a= absorptiviteit van de gekleurde stof, (L/g.cm)a= absorptiviteit van de gekleurde stof, (L/g.cm) b= dikte van de absorberende laag (cm)b= dikte van de absorberende laag (cm) c= concentratie van het te bepalen bestanddeel (g/L)c= concentratie van het te bepalen bestanddeel (g/L)

Formule sulfiet c= V * MW *  A ε * d * v * 1000 ε * d * v * 1000 = 3,060*64,06 *  A (g/L) = 3,060*64,06 *  A (g/L) 6,3 * 1 * 0,1 * ,3 * 1 * 0,1 * 1000

Formule L-ascorbinezuur c= V * MW *  A ε * d * v * 1000 ε * d * v * 1000 = 2,700*176,13 *  A (g/L) = 2,700*176,13 *  A (g/L) 16,9 * 1 * 0,1 * ,9 * 1 * 0,1 * 1000

Formule glucose c= V * MW *  A ε * d * v * 1000 ε * d * v * 1000 = 3,020*180,16 *  A (g/L) = 3,020*180,16 *  A (g/L) 6,3 * 1 * 0,1 * ,3 * 1 * 0,1 * 1000

Alternatieven bepaling L- ascorbinezuur Titratie met DCPIP-oplossing. Titratie met DCPIP-oplossing. DCPIP (2, 6-dichloorfenol-indofenol ) is in een basisch milieu blauw en in een zuur milieu rood. Door de werking van vitamine C wordt de stof gereduceerd. Er ontstaat dan een kleurloze stof. Titreren tot een rode kleur. HPLC HPLC

Enzymen Oxidoreductasen: enzymen die redoxprocessen katalyseren. Transferasen: deze enzymen katalyseren de overdracht van een bepaalde functionele groep van de ene molecule naar de andere. Hydrolasen: veroorzaken een hydrolytische splitsing (onder invloed van water) Lyasen: katalyseren additiereacties aan dubbele bindingen. Isomerasen: katalyseren omleggingen in de moleculen zelf. Ligasen: veroorzaken een binding tussen twee moleculen, meestal gekoppeld aan de hydrolyse van een ATP molecule. Kinasen: katalyseren de transfer van een fosfaatgroep uit ATP naar een substraat.