De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Eiwitzuivering 4 Sigrid BeiboerTBEMH-P05IDB HC8 Een praktijkvoorbeeld Specifieke en totale activiteit Recovery en zuiveringsfactor Wat te doen met eiwitten?

Verwante presentaties


Presentatie over: "Eiwitzuivering 4 Sigrid BeiboerTBEMH-P05IDB HC8 Een praktijkvoorbeeld Specifieke en totale activiteit Recovery en zuiveringsfactor Wat te doen met eiwitten?"— Transcript van de presentatie:

1 Eiwitzuivering 4 Sigrid BeiboerTBEMH-P05IDB HC8 Een praktijkvoorbeeld Specifieke en totale activiteit Recovery en zuiveringsfactor Wat te doen met eiwitten?

2 Voorbeeld eiwitzuivering

3 Inventarisatie van beschikbare gegevens: ppPLA2: porcine pancreatic phospholipase A 2 Gekloneerd in Escherichia coli als pro-enzym (proPLA 2 ) DNA en aminozuursequentie van proPLA 2 is bekend ◦ Mature enzym: 124 aminozuren, 14 kDa ◦ Prosequentie: 7 aminozuren pI bekend: 6,3 Stabiel eiwit (7 zwavelbruggen): goed resistent tegen bevriezen, ontdooien, bewaren bij KT en pH 4-9 Kristalstructuur is bekend Enzymatische activiteit is bekend Strategie eiwitzuivering, een voorbeeld

4 Structuur van PLA 2

5 Enzymatische activiteit van PLA 2

6 Schema eiwitzuivering van PLA 2 uit E.coli Homogenisatie + centrifugatie bacteriecellen Centrifugatie + eiwitten PLA 2 in eiwitmengsel Ionchromatografie (bij pH 4) Dialyse Ionchromatografie (bij pH 6) Dialyse FPLC

7 10 L Kweek medium met bacteriecellen Centrifugeren Bacteriecellen in 300 ml TE buffer (pH 8) + 75 gr. sucrose Resuspenderen 60 mg lysozym toevoegen 300 ml TE buffer toevoegen Sonificeren in 100 ml porties (3*90 sec op ijs) Triton X-100 toevoegen tot 0,1% eindconcentratie Sonificatie (3*1 min op ijs) Pellet resuspenderen in 400 ml TE buffer Sonificatie (1 min op ijs) Mengen, 30 min op ijs Centrifugeren Pellet met inclusion bodiesHomogenisatie

8 Hervouwing van proPLA 2 7 M guanidine: pellet met inclusion bodies lost op Thannhauser reagens sulfoneert eiwit (S-SO 3 - ) IJsazijn precipiteert eiwit Centrifugatie en wassen van eiwit met water (2x) 8 M ureum: gesulfoneerd eiwit lost op 4 x verdunnen met buffer met cystine en cysteine: - 2 M ureum eindconcentratie, - hervouwing (o/n, 4ºC) - vorming juiste zwavelbruggen Gerenatureerd proPLA 2

9 Activatie van PLA 2 CaCl 2 : PLA 2 heeft Ca 2+ nodig voor enzymactiviteit pH instellen (8,3) Trypsine: 5% (w/w) eindconcentratie (hoeveelheid proPLA 2 geschat met SDS-PAGE) Trypsine knipt prosequentie eraf en activeert PLA 2 PLA 2 enzymactiviteit volgen met enzymbepaling Geen toename enzym activiteit: ◦ - pH naar 4,5 met ijsazijn ◦ - trypsine inactief bij pH 4,5

10 Activatie van PLA 2 volgen met bepaling van enzymactiviteit Enzymactiviteit Actief PLA 2 Vrijgekomen vetzuur titreren met loog t = 1 t = 4 t = 3 t = 2 Loog (mmol) Tijd (min.)

11 Zuivering van PLA 2 met ionchromatografie Centrifugatie: verwijdering van geprecipiteerd eiwit SP-Sephadex C25 bij pH 4 - kolom wassen met 4 kolom volumes NaAc - elutie PLA 2 met zoutgradiënt (0 – 0,8 M NaCl) Dialyse tegen 5 mM azijnzuur CM-Cellulose bij pH 6 (elutie met 0 – 0,4 M NaCl)

12 Zuivering met kolom chromatografie Fractieverzamelaar: - meet OD 280 en geeft dit door aan recorder - verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en geeft buiswisseling ook door aan recorder OD 280 Eiwitoplossing in deze 2 buizen wordt verzameld en gedialyseerd

13 t = 0 t = 3 min mmol loog in 3 min Loog (mmol) Tijd (min.) Stel, 20 ml zuiver PLA 2 van 0,117 mg/ml (20 * 0,117 = 2,34 mg PLA 2 ) Enzymbepaling met 300  l geeft 4,05  mol loog/min = 4,05 I.U. 4,05 / 0,3 = 13,5 I.U./ml Specifieke activiteit (S.A.): 13,5 / 0,117 = 115 I.U./mg Totale activiteit:20 * 13,5 = 270 I.U.Activiteit

14 Internationale Units (IU) Definitie: 1 IU is die hoeveelheid enzym die in staat is om 1  mol/min substraat om te zetten of product kan vormen onder omschreven condities (pH, T, substraat, buffer) Vraag: Waarom IU en geen mol/l?

15 Als je een enzymbepaling doet, dan Moet [S].....? Moet de pH.....? Moet de temperatuur ?

16 Als je een enzymreactie spectrometrisch wilt volgen, dan a) Moet het substraat absorberen b) Moet het product absorberen c) Moeten het substraat en het product absorberen d) Mogen het substraat en het product niet absorberen

17 Vb. kwantificering zuiver ppPLA 2 Spectrofotometrisch OD 280 Meten tussen OD 280 0,1 en 1 en blanco stellen met buffer Tryptofaan, Tyrosine en in mindere mate phenylalanine en alle zwavelbruggen  1 Trp1*0,4 = 0,4  8 Tyr8*0,1 = 0,8  5 Phe + 7 S-S = 0,1  E 1mg/ml 1,3 OD 280 = 0,78  0,78/1,3 = 0,60 mg/ml

18 Zuivering en recovery Recovery of yield: totale activiteit na bepaalde stap gedeeld door totale activiteit voor zuivering Zuiveringsfactor: specifieke activiteit na bepaalde stap gedeeld door specifieke activiteit voor zuivering

19 Recovery (%)Zuiveringsfactor ,2 836, Totaal (begin – einde zuivering): - recovery = 45% - zuivering = 1500 Per stap En wat is de totale recovery na de eerste 3 zuiveringsstappen?

20 Karakterisatie Aminozuur sequentie Drie dimensionale structuur : NMR, X-ray kristallografie Massaspectrometrie Stabiliteit (PLA 2 : toename tyrosine signaal bij hogere guanidine-HCl concentraties) Biologische activiteit: - affiniteit - enzymactiviteit

21 Ca 2+ affiniteit van PLA 2 K Ca 2+ (mM)S.A. (U/mg) 12,40,9 1,61,6 WT ( ) Mut ( )

22 pH optimum van PLA 2 pI PLA 2 6,3 Mut5,6 TAA is een onnatuurlijk aminozuur: - Lijkt erg op histidine - pK a (TAA) is 4 eenheden lager dan pK a (His) TAA: 1,2,4-triazole-3-alanine

23 Interface activering van PLA 2 Micelvorming: - voldoende substraat - detergens toevoegen

24 Massaspectrometrie Ionisatie moleculen in gasfase Versnelling ionen in elektrisch veld Scheiding ionen op basis van hun massa/ladingsverhouding Detectie Snel (steeds meer gebruikt, mn ziekenhuizen) Nauwkeurig (dalton)

25 Bepaling van de ruimtelijke structuur NMR X-ray kristallografie Modelling: homologie (sequentie of functie domein) zoeken met eiwitten van bekende structuur Lysozyme Lactalbumin

26 Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Atoomkernen van sommige isotopen hebben magnetische momenten Deze is afhankelijk van omgeving Gebruik: - eiwitstructuur bepaling - volgen metabolisme (ziekenhuizen)

27 X-ray kristallografie

28 Protein engineering

29 Protein engineering bij Genencor, Leiden Voorbeeld: alpha amylases met verhoogde stabiliteit, veranderde calcium- bindende eigenschappen en verbeterde werking bij lage pH. Beste eigenschappen van 2 soortgelijke eiwitten combineren

30 Proteomics in drug discovery

31 Biochemistry vs. Proteomics


Download ppt "Eiwitzuivering 4 Sigrid BeiboerTBEMH-P05IDB HC8 Een praktijkvoorbeeld Specifieke en totale activiteit Recovery en zuiveringsfactor Wat te doen met eiwitten?"

Verwante presentaties


Ads door Google