BRCA diagnose bij familiale borstkanker

Presentatie over: "BRCA diagnose bij familiale borstkanker"— Transcript van de presentatie:

1 BRCA diagnose bij familiale borstkanker

2 Aantal borstkankers per jaar
Borstkanker bij vrouwen: Eierstokkanker: Borstkanker bij mannen: (bron: Nationaal Kanker Register, 2006) EIERSTOK- KANKER

3 Kanker – Familiale kankers
kanker is het gevolg van somatische mutaties de meeste kankers zijn sporadisch (toevallig) borst- of eierstokkanker treft één vrouw op 10 bij 10% is er een familiale geschiedenis van borst- of eierstokkanker kanker zelf is niet erfelijk, sommigen erven een genetische voorbeschiktheid om kanker te ontwikkelen

4 Borstkankergenen: BRCA1 en BRCA2
Kans op borstkanker bij BRCA1/2 mutatie Leeftijd Algemeen BRCA1/2 35 jaar 3/1000 1/100 45 jaar 3/10 55 jaar 3/100 5/10 85 jaar 1/10 8/10 2 grote genen: BRCA1 (op chromosoom 17): baseparen (1863 aminozuren) BRCA2 (op chromosoom 13): baseparen (3418 aminozuren) Het onderzoek is complex en daarom voorbehouden aan familiale gevallen.

5 BRCA1

6 BRCA2

7

8 Sanger sequencing Sequencing - ddNTP

9

10

11 Gen – Exon – PCR - Sequencing

12 BREAST AND OVARIUM CANCER
Three or more familial cases Unselected cases ? 20-25 % BRCA1 5-10 % BRCA1/2 10-15 % BRCA2

13 Risico’s op borstkanker

14 Indicaties voor mutatie-analyse
Goede selectie van families  3 aangetasten (en sommigen < 50) families met  2 BRCA +  1OVCA families met  3 BRCA onder 50 j 2 eerstegraadsverwanten met  2 CA onder 50 j families met borst-en ovariumcarcinoom (BRCA1) families met borstcarcinoom bij mannen (BRCA2) borstkanker < 30j (ook bij unieke casus) minimum 1 aangetaste persoon in leven

15 Moleculaire diagnostiek
Diagnostische test Predictieve of presymptomatische test

16 ? eierstok borstkanker prostaatkanker ? kanker ? borstkanker 40 j

17 Predictieve genetische test
Familiale BRCAX mutatie is gekend Genetische test bij niet aangetaste verwant raadpleging geneticus voor medische informatie counseling bij psycholoog bloedname voor analyse (+bespreking van risico’s) raadpleging geneticus voor bespreking resultaat bespreking praktische aspecten van opvolging organisatie van psycho-sociale follow-up

18 Predictieve genetische test
Multidisciplinair team - gynecologie/gynecologische oncologie/ sinologie/heelkunde/plastische chirugie - klinische genetica/sociale verpleegsters - psychologen/psychiatrie

19 Borstkankeronderzoek CME - UZLeuven
2058 families  patiënten (DNA) onderzocht: ≈ 2300 families met mutaties in BRCA1/2: gezonde familieleden onderzocht: Aantal predictieve testen per jaar:

20 Predictieve genetische test
Follow-up bij positieve test: psycho-sociale counseling profylaxie bij negatieve test: terugval op bevolkingsrisico

21 Probleemsituaties Geen familiale mutatie gekend
beleid baseren op statistische risico’s computer programmas, tabellen van Claus. Mutatieanalyse is tijdrovend Informatiedoorstroming in familie bij at risk individuen Geen predictieve BRCAX testen zonder toestemming en bij minderjarigen

22 40y no mut in BRCA1 37y p.M1V in BRCA1 c.7265 del A in BRCA2 I.1 I.2
III.1 III.2 40y no mut in BRCA1 III.3 37y p.M1V in BRCA1 III.4 c.7265 del A in BRCA2

23 Massive parallel sequencing
Roche GS FLX (454 Life Sciences) 250 bp (450 bp) per fragment bp ( bp) per run (8 h) 12-15 Gb of data per run Illumina Genome Analyzer II (Solexa) - HiSEQ Applied Biosystems SOLiD 3 (Agencourt) 25-35 bp per fragment 1 to bp per run (days-weeks) 1-10 Tb of data per run First introduced in 2005 NEXT GENERATION SEQUENCING

24 BRCA onderzoek op het ‘NEXT GENERATION SEQUENCING’ platform
volledige BRCA1 en BRCA2 sequencing analyse voor 40 (eventueel 80) patiënten in één run Voordelen hogere capaciteit beperking van wachttijden lagere kost per patiënt Uitdaging snelle data-analyse

25 gDNA sstDNA library Genome fragmented by nebulization
DNA fragments are treated so that they can be retrieved and further processed The aim is to obtain the sequence of individual fragments after which the sequence data will be assembled again. The problem is that millions of these fragments are present in a solution – so you need ways to isolate them and then to amplify them in such a way that they become readable. Single molecule, and there are no means today to determine or even identify such an individual fragment, let alone to do it a million times. Genome fragmented by nebulization sstDNA library created with adapters A/B fragments selected using streptavidin-biotin purification

26 Clonally-amplified sstDNA attached to bead
DNA polymerase dNTPs You should realize that eventually, between and a million fragments will be sequenced in one run. Size of the beads: 28 µm PCR in mayonnaise ~106 microreactors per ml All processed in parallel Anneal sstDNA to an excess of DNA capture beads Emulsify beads and PCR reagents in water-in-oil microreactors Clonal amplification occurs inside microreactors Break microreactors, enrich for DNA- positive beads sstDNA library Clonally-amplified sstDNA attached to bead

27 Anneal single-stranded library DNA molecules to capture beads.
Distribute millions of beads in thermo-stable water-in-oil emulsion. Microreactors contain complete amplification mix. Thermocycle. Isolate and purify only beads with amplified DNA.

28 75 picoliter volume wells 480 wells/mm2 1,600,000 wells per 60 x 60mm
Load beads into PicoTiterPlateTM Well diameter: average of 44 µm A single clonally amplified sstDNA bead is deposited per well. DNA beads packed into wells with surrounding beads and sequencing enzymes. 400,000 reads obtained in parallel on large format PicoTiterPlate device 75 picoliter volume wells 480 wells/mm2 1,600,000 wells per 60 x 60mm ≈ 44 µm

29

30

31 Method has been improved by other laboratories, e.g. deletion testing
Cost: $ 2480 (approx. € 2100 or £ 1400) (€ 3980 if purchased via Bioscientia) Licenses ? $ plus $50/test for a test of 5 mutations, $150 for 6-20 mutations Method has been improved by other laboratories, e.g. deletion testing

32 Matthijs G. The European opposition against the BRCA gene patents.
Familial Cancer. 5: (2006)

33 District Court, New York Patients and professional societies
BRCA1/BRCA2 gene patents invalidated Judge R. Sweet District Court, New York 152-page decision Patients and professional societies March 28, 2010

34

35 Risk of breast cancer for relatives with BRCA1 or BRCA2 mutations
.2 .4 .6 .8 Cumulative breast cancer incidence 20 40 60 80 30 50 70 Breast cancer Age .02 .20 .37 .55 .71 .82

36 Risk of ovarian cancer for relatives with BRCA1 or BRCA2 mutations
.02 .21 .40 .46 .54 BRCA1 .02 .02 .06 .12 .23 BRCA2

37 Risk of breast cancer for relatives with BRCA1 or BRCA2 mutations
by birth cohort 20 40 60 80 30 50 70 Age Cumulative breast cancer incidence .2 .4 .6 .8 1.0 born < 1940 born > 1940

38 Age at breast cancer diagnosis among probands with BRCA mutations
by physical activity as a teenager, adjusted for birthyear