De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) • Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te meten - bijv. insuline in bloed • Berust op binding tussen.

Verwante presentaties


Presentatie over: "Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) • Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te meten - bijv. insuline in bloed • Berust op binding tussen."— Transcript van de presentatie:

1 Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) • Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te meten - bijv. insuline in bloed • Berust op binding tussen antilichaam (Ab) en antigeen (Ag) 96 wells plaat: 8 rijen (A-H) en 12 kolommen (1-12)

2 Doel van ELISA experiment Het uitvoeren van een kwantitatieve immunologische bepaling • Wat heb je hiervoor nodig? • Gezuiverd antigeen. In deze practicumproef is dat humaan insuline (Ag) • Een deel wordt gebruikt voor opwekken antilichamen • Een deel (1 mg/ml) wordt gebruikt voor calibratie • Een deel Ag wordt voorzien van biotine groep (AgB)

3 één putje van een 96-wells plaat ELISA procedure • Competitie tussen biotine gelabeld (AgB) en ongelabeld antigeen (Ag) • Hoeveelheid gebonden AgB wordt bepaald met avidine-gelabeld HRP

4 Uitvoering • Allereerst moet het percentage werkzame IgG moleculen worden bepaald. Dit doe je door bij een variabele IgG concentratie (A-H) te bepalen wat de minimale hoeveelheid Ag (1-12) is waarbij alle AgB nog gebonden blijft.

5 Antilichaam aan putje binden Bereken de verdunning die je in moet vullen en noteer alle informatie!

6 Percentage werkzame antilichamen Coat IgG: Voeg 100 µl IgG (Ab) toe aan elk putje Maximale bindingscapaciteit van IgG per putje is 4 µg/ml, dus 100 µl x 4 µg/ml = 400 ng Niet gebonden antilichaam wegwassen Alle eiwit bindingsplaatsen bezetten/ blokkeren

7 Biotine-gelabeld antigeen (AgB) toevoegen • Per putje 10 µl insuline (AgB), steeds dezelfde concentratie • Maximaal 1 ng per putje zodat niet alle antilichamen zijn gebonden

8 Ongelabeld antigeen (Ag) toevoegen • in elk putje 100 µl ongelabeld antigeen (Ag) • in elke kolom een andere concentratie (12 kolommen) • begin met overmaat (bijv. 100 ng) en verdun steeds met factor 2 Ongebonden antigeen wegwassen

9 Avidine-peroxidase toevoegen • Avidine bindt zeer sterk aan biotine • Peroxidase is een enzym Ongebonden avidine-peroxidase wegwassen

10 Substraat voor peroxidase toevoegen Peroxidase zet substraat om in kleurstof waarvan de absorptie gemeten kan worden

11 Stoppen kleurreactie

12 Absorptiewaarden voor kleurstof Daar waar de absorptie afneemt treedt competitie op! Reken uit hoeveel procent van het antilichaam aan het antigen heeft gebonden: (Ag+AgB)*15/(Ab)*100 % IgG ng/well A0,1860,2970,6551,2481,7131,7101,6491,6901,6961,6831,6921,664250,000 B0,0370,1930,3660,6451,2271,6681,6861,6441,6681,6271,6731,665125,000 C0,0530,1230,1840,3520,5901,0021,4021,6521,6411,6341,6661,66862,500 D0,0310,0560,1180,1890,2520,5080,7991,1671,5081,7131,7021,63531,250 E0,000 0,0150,0460,1850,2220,3710,5670,7630,8700,9560,98115,625 F0,000 0,0430,1030,1370,2050,3410,3510,4750,4760,5167,813 G0,0430,000 0,0470,0200,1010,0810,169 0,1820,2400,2013,906 H0,000 0,0120,0400,0230,0540,0850,0630,1410,1130,1021,953 AgB (ng/well)0,83 Ag (ng/well)80,0040,0020,0010,005,002,501,250,630,310,160,080,04 Ag + AgB (ng/well)80,8340,8320,8310,835,833,332,081,461,140,990,910,87

13 Voorbeeld van een testcurve Neem daarna een nieuwe plaat voor het maken van een optimale calibratiecurve

14 Test voor een optimale calibratiecurve A0,1500,2340,3220,4240,5640,6350,8601,1431,3931,8181,7711,764 B0,1590,2000,3400,3860,5150,6540,8941,0771,3591,7771,7711,776 C0,2030,2690,3090,3690,5360,6190,8471,1271,3821,7571,8371,817 D0,1490,2520,3340,3830,5410,7060,8861,0631,4331,7641,7721,821 E0,1580,2010,3250,4010,4840,7020,9011,1421,3861,7721,7811,772 F0,2340,2060,3400,3770,5600,6800,8591,1411,4311,7911,8261,774 G0,2340,2230,3540,4230,4940,6270,8141,0571,4201,8011,7891,768 H0,2210,2010,2710,3980,5270,6280,8321,1261,4391,7741,8251,799 gem.0,1890,2230,3240,3950,5280,6560,8621,1101,4051,7821,7971,786 Ag + AgB (ng/well)80,862,448,237,228,822,417,413,610,68,46,65,3 Ag (ng/well)80,0061,5447,3436,4128,0121,5516,5712,759,817,545,804,46 IgGng/welldilution 250,01,0 AgBng/well 0,831,0 Agng/well 80,01,3

15 Test voor de calibratiecurve

16 Ag concentratie in monster bepalen Concentratie Ab constant houden Kolom 1-6: calibratieKolom 7-12: monster

17 Ag concentratie in monster bepalen Kolom 1-6: calibratiecurve Kolom 7-12: monster Ab concentratie constant

18 Ag concentratie in monster bepalen A0,2930,3710,5170,6500,9251,1920,3660,4280,5900,6950,9041,189 B0,3130,3740,5600,6740,8791,1610,3010,3910,5890,7290,9231,205 C0,3190,4100,5610,7420,8721,1320,3680,3820,5710,6980,8861,180 D0,3580,4300,5870,7320,8731,1180,3550,3860,5720,6900,8671,170 E0,3310,4570,5650,6760,8571,2110,3630,3800,5370,7230,8571,197 F0,2850,4500,5610,7040,9341,1970,2870,3760,5150,7280,9471,116 G0,3460,4570,5310,7230,8771,1930,2740,4400,5580,7000,8681,176 H0,3250,4440,5590,6770,9421,1740,3700,4150,4950,6800,8791,140 gem.0,3210,4240,5550,6970,8951,1720,3360,4000,5530,7050,8911,172 Ag + AgB (ng/well)80,862,448,237,228,822,4 Ag (ng/well)80,0061,5447,3436,4128,0121,55 Sample (ng/well)800,00615,38473,37364,13280,10215,46 IgGng/welldilution 250,01,0 AgBng/well 0,83 Agng/well 80,01,3 Sampleng/well 800,01,3

19 Optimale calibratiecurve

20 Monster curve

21 Berekening hoeveelheid insuline in monster Sample Y-value (absorban ce) X-value (ng sample ng AgB) X-value calibration curve Ag in sample (ng) mg Ag / mL sample Getallen trendlijn a25,6260,891280,129,328,51,017E-01 b-0,994 0,035 -3,359 3,379 y = 25,626x -0,994 Y/a ln (Y/a) ln (Y/a)/b e ^ (ln (Y/a) / b)

22 Opdrachten - Het bepalen van het percentage werkzame IgG moleculen in het gezuiverde IgG preparaat Vuistregels: zie kader blz Testcurve en kwantitative analyse van het insuline monster Verslag - progress report! - het preparaat dat getest is - het percentage werkzame antilichamen - de testcurves en de curves van ijklijn en monsterverdunningen - de berekening van de concentratie insuline in het monster Opdrachten en verslag


Download ppt "Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay (ELISA) • Techniek om stoffen bijv. eiwitten in monsters te meten - bijv. insuline in bloed • Berust op binding tussen."

Verwante presentaties


Ads door Google