Apr. Klin. Biol. Koen Desmet Laboratoriumgeneeskunde UZ GHB - Leuven HbA1c : welke methode, welke calibratie Werkgroep Biologen Antwerpen 5/12/2005 Apr. Klin. Biol. Koen Desmet Laboratoriumgeneeskunde UZ GHB - Leuven

DCCT Nine-year study concluded: Improved glycemic control is an effective preventive strategy for reducing the risk of retinopathy, nephropathy, and neuropathy In IDDM (insulin-dependent diabetes mellitus) patients, intensive insulin treatment: Delays the onset and slows the progression of microvascular complications Produces significant financial savings when part of long- term monitoring and control

HbA1c HbA1c results monitor glucose control over the preceding 90 to 120 days Complete normalization of glycemia levels may prevent complications Quarterly HbA1c determination recommended for all insulin-treated patients

HbA1c - terugblik in de tijd? 50 % van het HbA1c resultaat is afkomstig van glucosespiegels van 30 dagen terug slechts 10 % is afkomstig van glucosespiegels die 90 à 120 dagen teruggaan. 25 % van het HbA1c werd gevormd in de voorbije 12 dagen 90 % gedurende de laatste 62 dagen. Rohlfing et al. Diabetes Care 25:275-278, 2002 Zielke R., Henrichs H.R., Klin. Lab. 39:988-990, 1993

HbA1c diagnostisch? EPIC –Norfolk study Cardiovaculair risico neemt toe zelfs binnen het normale bereik Laagste risico bij HbA1c < 5% 1% stijging is geassocieerd met 1,24 (mannen) en 1,28 (vrouwen) relatief risico in mortaliteit Verband met coloncarcinoom?

Reactie van Maillard (1912) Definitie van de Maillard condensatiereactie: nucleofiele additie van een vrije amine-functie van bv. een aminozuur, peptide of proteïne op een carbonylgroep van een reducerende suiker Door verdere omzetting ontstaan vluchtige stoffen en gepolymeriseerde complexen = Niet enzymatische bruinverkleuring

niet enzymatische glycatie Amadori-omlegging K+1 -N-CH2 Hb C=O HC-OH HO-CH _ CH2OH H K2 Hb -NH2 + HO-CH CH2OH O=CH HC-OH _ Hb -+HN=CH HC-OH HO-CH _ CH2OH K-1 Hemoglobine Glucose Aldimine (Schiffse base) Ketoamine niet enzymatische glycatie

Glyceringsplaatsen op Hb b-Val-1 a- Lys-16 b- Lys-66 b- Lys-17 a- Val-1 a- Lys-7 a = 141 aminozuren b- Lys-120 b = 146 aminozuren b a a b H. Reinauer: Klin.Lab. 1993; 984-87

Approximatieve graad van glycering 60 % thv b-N-Valine 6 % thv a-N-Valine 18 % thv b-e-Lysine-residu 16 % thv a-e-Lysine-residu

Glycohemoglobine Meer dan 20 methodes commerciëel beschikbaar Methoden gebaseerd op fysische chemische eigenschappen antilichaam-herkenning Interferentie door structurele varianten en chemische afgeleiden zijn bekend

Glycohemoglobinemethodes

Methoden in EKE

Kationuitwisselingschromatografie BioRex 70 temperatuursafhankelijk interferentie door lipiden labiele fractie (Schiffse base) interferentie Ge-automatiseerde HPLC systemen Menarini, Tosoh, Hitachi, BioRad, Home made (bv. Mono-S kolom)

Kationuitwisselingschromatografie Omzeilen van labiele fractie interferentie: incubatie in fys. zoutopl. (bv. 4 h bij 37 °C) chemische hulpmiddelen (ev. in situ) Vermijden van ontaarding van het Hb koeling van de staalcompartiment on line hemolyseren Minimaliseren van kolomvervuiling spoelprocedures

Chromatogram Bio Rex 70 HbA0 ? HbA1c

BioRad Variant II

H/LPLC specificiteit α α-glyc α β β β-glyc α α β-glyc α-glyc β-glyc Peterson K.P., Clin. Chem. 1998; 44:9 , 1951-58

Affiniteitschromatografie CH2-NH-Hb C=O HC-OH HO-CH _ HO-CH2 HO OH B- -NH- + O OH B- -NH- CH2-NH-Hb C=O HC HO-CH _ HO-CH2

Affiniteitschromatografie Geen significante invloed van: temperatuur uremie foetaal hemoglobine labiele Schiffse base Specificiteit van de binding ? (glycoHb)

Immuno-assay schematisch 5 µL bloed 250 µL hemolyse reagens manueel 5 min. wachttijd toestel HbA1c bepaling Hb bepaling immunologisch colorimetrisch ratio HbA1c/Hb HbA1c %HPLC = a · ratio HbA1c/Hb + b

Peptidevorming Pepsine Gluc Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser

Immunoassay - Roche glycopeptiden antibody latex bound glycopeptiden agglutinator agglutinated latex

Interferenties IEC/HPLC AC Immunoassay Labiele fractie + / - - Carbamylering + / afh. Acetylering Hb-variant - afh. Hb-F

Hb afgeleiden Gekende chemische veranderingen van het Hb gecarbamyleerd Hb bij uremische patiënten geacetyleerd Hb bij chronisch gebruik van hoge dosis acetylsalicylzuur verbinding van Hb met acetaldehyde i.g.v. alcoholisme

Gecarbamyleerd Hb NH2 C O ureum NH4+ + C = O -N cyanaat N Hb H NH2 C O Ch. M. Niederau et al. : Klin.Lab. 1993; 1015-23

Gecarbamyleerd Hb Vorming a rato van : 0,06 % per mmol/L ureum 0,01 % per mg/dL ureum (d.i. bij 20 – 40 mg/dL: 0,2 à 0,4 %)

EKE-stalen – chromatografie IFCC DCCT Tosoh Hitachi 8121 8140 Diastat Variant Variant II Euro n° 123 3,3 5,2 3,9 5,0 5,3 118 5,8 7,5 7,6 5,7 7,2 7,4 7,0 7,3 117 8,0 9,5 9,8 9,2 8,8 9,0 9,3 9,4 120 10,8 10,6 8,4 10,2 10,4 10,1 10,0 10,3 115 4,0 5,9 8,9 8,5 124 5,5 Staal 115 en 124 bevatten gecarbamyleerd Hb, resp. 3 en 1,5 %

EKE-stalen – immunoassay/eF IFCC DCCT Roche Unimate Roche Tinaq. Dade Dimens. Bayer DCA Beckman Diatrac Euro n° 123 3,3 5,2 5,4 5,7 5,5 4,3 118 5,8 7,5 6,8 7,6 8,0 7,0 117 9,5 9,4 10,0 10,2 8,8 120 10,8 11,5 11,4 10,6 11,0 9,8 115 4,0 5,9 6,0 124 6,4 6,1 Staal 115 en 124 bevatten gecarbamyleerd Hb, resp. 3 en 1,5 %

Euro 118

Euro 115

Hb varianten >700 Hb varianten gekend meestal puntmutaties in de a,b,g,d keten van Hb gHb meting heeft ontdekking van nieuwe varianten meegebracht meestal zonder fenotypische abnormaliteit Op een totaal van ± 16 miljoen diabetici in de VS zijn >150 000 drager van een aberrant Hb HbS en HbC meest voorkomend

Hb varianten - > 40 % mogelijk 5,3 % Azië 2 - 5 % 13 % Turkije 1 % 5,3 % Azië 2 - 5 % 13 % Turkije 1 % sporadisch 0,3 - 1,3 % 1 - 8 % USA 0,6 % 0,2 % Frankrijk b-Thallasemie HbAE HbEE HbSS HbAS

HbA1c igv abnormaal Hb

HbA1c igv abnormaal Hb

cf. NGSP website : http://www.missouri.edu/~diabetes/ngsp.html

Biologische Variatie van GHb in non-diabetici Rohlfing C. et al., Clin. Chem. (2002) 48, n° 7, 1116-18

Biologische Variatie van GHb in non-diabetici Rohlfing C. et al., Clin. Chem. (2002) 48, n° 7, 1116-18

Intra-individuele CV diabetespatiënt Phillipou et al. 4,2 % (4 mnd – maandelijks) 7,1 % (15 mnd – 3-maandelijks) Petersen et al. 4,1 % (“fair control”) 5,2 % (“poor control”) Cembrowski et al. 2,4 % (3 mnd – maandelijks) 4,1 % (12 mnd – maandelijks)

Analytische CV CVa  0,5 CVi 2,1 à 3,6 % Phillipou 1,2 à 2,1 % Cembrowski Bij een CVa van 4 % kan een verandering in HbA1c van 0,5 % met 75 % kans als een daadwerkelijke verandering beschouwd worden Cotlove E et al. Clin.Chem. 1970;16: 1028-32

Analytische CV van NGSP en IFCC QC programma voor IFCC-NRL Intralab : 1,0 – 1,2 % (range 0,5 – 2,2%) Interlab : 1,4 – 1,9 % QC tijdens de 4 studies – Marrakech (’01), Chicago (’01), Kyoto I (’02) en II (’03) Intralab : IFCC 1,1 % (range 0,4 – 2,1) NGSP 1,0 % (range 0,5 – 2,4) Interlab : IFCC en NGSP 1,9 % Hoelzel W. et al.: Clin.Chem. 2004, 50:1; 166-174

Long term CV – iQC Low

Noorse studie (566 huisartsen) 3,2 % CV between office (DCA-2000) CVa 2,2 % nodig om DALING vast te stellen door 50 % van de artsen (95% CI) CVa <0 % nodig om STIJGING vast te stellen door 50 % van de artsen (95% CI)

Cijferverwarring Verschillende resultaten tgv afwezigheid van een internationaal aangenomen standaard verandering gebracht door NGSP- en IFCC groep Moeilijk vergelijkbaar resultaten van laboratoria onderling kunnen aanleiding geven tot verwarring tussen clinici meestal is dit probleem niet goed gekend bij de clinici Gevolg: suboptimale diagnostische en therapeutische acties

DCCT studie Referentiesysteem Laboratoria : Univ. of Missouri Univ. of Minnesota

DCCT gevolgen Oprichting NGSP (1996) National Glycohemoglobin Standardization Program Onderschrijven door ADA (1997) van NGSP UKPDS gebruikt NGSP gecertificeerde methode

Summary of NGSP Certification Categories Certification Type # samples compared Precision Criteria Bias Criteria Monitoring (yes / no) Monitoring Protocol Manufacturer 40 4 %* 95% CI of differences within ±1% GHB no - Level I Lab 40 3 % 95% CI of differences within ±0.75% GHB yes 10 samples quarterly Level II Lab 40 4 %* 95% CI of differences within ±1% GHB no - * 5% until July 2002

DCCT – standaardisatie HbA1c NCCLS C44-A : Harmonization of Glycohemoglobin Measurements; Approved Guideline december 2002

EU directive The EU directive states that "The traceability of values assigned to calibrators and/or control materials must be assured through available reference measurement procedures and/or available reference materials of a higher order". Therefore, for all products sold in Europe, manufacturers must make their products results "traceable" to the IFCC Reference Method.

IFCC – standaardisatie HbA1c Standardization shall be based on the stable adduct of glucose to one or both N-terminal valines of the b-chains of hemoglobin. b-N-(1-deoxyfructosyl)hemoglobine NDFH

IFCC – standaardisatie HbA1c Primary Reference Material: For the calibration of the reference method, mixtures were made of pure HbA1c and pure HbA0. These fractions were isolated using cation exchange and affinity chromatography, and characterized using capillary isoelectric focusing, and electrospray ionization mass spectrometry. Finke A et al. Clin Chem Lab Med 1998; 36: 299-308

IFCC - standaardisatie

IFCC - standaardisatie Val Gluc His Leu Thr Pro Glu Lys Ser Endoproteinase Glu-C Trypsine Pepsine Gluc Val His Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser

IFCC - standaardisatie

NGSP vs IFCC (NGSP-HbA1c) = 0.915 (IFCC-HbA1c) + 2.15 Clin.Chem.2004;50:166-174

ADA/EASD/IDF werkgroep London, jan. 2004 Doel: evaluatie van opportuniteit geboden door de IFCC referentie methode aanbevelingen bij implementatie hiervan

ADA/EASD/IDF werkgroep London, jan. 2004 Synopsis: akkoord om IFCC als anker te gebruiken waarnaar de firma’s hun methode zouden moeten refereren vaststelling dat HbA1c resultaten 1 à 2% lager zullen zijn maw cutoff waarden van normaal en goede / slechte controle worden kleiner discussie rond rapportage IFFC resultaat ? DCCT resultaat omgerekend via lineaire relatie ?

Rapportage als IFCC Voor: Tegen: geeft de ‘echte/juiste’ waarde weer gelegenheid voor re-educatie (professie en pt.) gelegenheid om HbA1c te redefiniëren Tegen: hoge kosten en re-educatie vergt tijd gedeeltelijke of geleidelijke implementatie zal de verschillen tussen laboratoria verergeren gevaar voor detoriatie van glucose controle

Behoud van huidige resultaten Voor: gekend door clinici en patiënten gebaseerd op ‘evidence based data’ (DCCT,UKPDS) Tegen: niet de ‘juiste’ waarde frekwent verward met glucose resultaten in landen waar mmol/L gebruikt gemiste kans om de belangrijkheid van de test te benadrukken

ADA/EASD/IDF werkgroep Concensus: A1c en HbA1c benaming schept verwarring De kleine getallen (bv. 7%) doet de pt niet direkt overtuigen dat zelfs een kleine verandering van 0,5-1% een serieuze impact heeft op zijn gezondheid De werkgroep meent de kans te moeten grijpen om de test te redefiniëren bv door een naamsverandering in de richting van iets dat MBG reflecteert

HbA1c vs MPG

HbA1c c mean plasma glucose MPG (mg/dL) = [35,6 x HbA1c (%)] - 77,3 of MPG (mmol/L) = [1,98 x HbA1c (%)] - 4,29 r(Pearson) = 0,82 Diabetes Care 25:275-278, 2002

HbA1c c mean plasma glucose Diabetes Care 25:275-278, 2002

IFCC-HbA1c c mean blood glucose MBG (mmol/L) = 1,84 x IFCC-HbA1c (%) Sacks D.B., Clin. Chem. (2005) 51, n° 4, 681-3

ADA/EASD/IDF werkgroep Concensus: bevesting door prospectieve studie rapportage van IFCC A1c% onder nieuwe naam (bv. MBG) met nieuwe grenzen in familiaire eenheden voordeel (duidelijke revisie van de test, minimale verwarring, verstaanbare eenheid/range voor de patiënt, diagnostisch?) nadeel (idee van proportionaliteit/lineair verband misschien niet in alle gevallen toepasbaar)

ADA/EASD/IDF werkgroep Stappen: onmiddellijk adoptie van IFCC referentie methode als nieuwe standaardisatie methode invoeren van IFCC methode als anker voor het internationaal certificatieproces (netwerk) Het IFCC en NGSP netwerk zal firma’s opleggen geen veranderingen in rapportage aan te brengen totdat studies zijn verricht

ADA/EASD/IDF werkgroep Stappen: op korte termijn nagaan of andere retrospectieve data gebruikt kunnen worden om verband te leggen op langere termijn (2004-2007) prospectieve studie ontwikkelen in # populaties om verband te bevestigen/aan te tonen plannen van publiek en professioneel info programma

Methode gecertificeerd traceerbaar naar DCCT http://www.nacb.org/temporary/glycated.htm: Guidelines … Glycated proteins (D. Goldstein) Methode gecertificeerd traceerbaar naar DCCT Eerst < 5% CV, nu < 3% (intralab.) QC systeem (commercieel en HM) Labo-eigen ref. interval bepalen , NGSP 5% ± 0,5 (1 SD). ADA richtlijnen < 7% en >8%, enkel voor methoden traceerbaar naar DCCT Overeenkomst tussen NGSP (DCCT) en IFCC