het perifere bloeduitstrijkje Jan Philippé, GAB, 23/01/07

Perifeer bloeduitstrijkje Wat leert een microscopische diff? De meerwaarde wordt ter discussie gesteld Sens en spec voor het vaststellen van een ernstige infectie zijn relatief laag met daarenboven een beperkte statistische betrouwbaarheid + variabel qua interpretatie (zeker voor de MLT buiten de routine  bijscholing!)  de geautomatiseerde apparatuur +:minder manueel werk, statistisch beter -:iets belangrijks kan gemist worden

Beperking manueel vs automatisch De referentiemethode is nog steeds de manuele diff van 400 WBC volgens NCCLS H20A

Perifeer bloeduitstrijkje Wat leert een microscopische diff? Welke indicaties in het 24h lab? Welke vragen dienen te worden beantwoord? Kan de MLT de antwoorden geven? Is op grond van EBM de microscopische diff het meest effectief bij het stellen c.q. uitsluiten van diagnoses?

Perifeer bloeduitstrijkje Wat leert een microscopische diff? Welke indicaties in het 24h lab? Verdenking neonatale sepsis* Verdenking leukemie bij zeer hoge celaantallen Onderscheid trombopenie vs pseudotrombopenie Verdenking trombotische trombocytopenische purpura ±: Hemodynamisch instabiele oudere patiënt met normaal aantal leucocyten en verdenking sepsis (beleidsverandering?) NIET: de ongeruste dokter *bij premature neonaten blijft de stijging van het aantal leucocyten soms uit en is de diff des te belangrijker.

Perifeer bloeduitstrijkje Wat leert een microscopische diff? Welke vragen dienen te worden beantwoord? -Onderscheid uitgerijpte vs jongere neutrofiele granulocyten -Herkennen blasten (“pluis”/”niet pluis”) -Trombocytenaggregaten en trombopenie -Schizocyten* (voor TTP en HUS; cut-off: 1%) *Betere terminologie fragmentocyten: schizocyten en ‘helmcellen’

Perifeer bloeduitstrijkje Wat leert een microscopische diff? Kan de MLT de antwoorden geven? In de praktijk blijkt dat ontgoochelend Toestellen scoren beter (immature) Trombocytenaggregaten/echte trombopenie stelt meestal weinig problemen, Leukemie? Bij hoge celaantallen: lukt meestal wel, maar back-up is hier noodzakelijk

Perifeer bloeduitstrijkje Wat leert een microscopische diff? Is op grond van EBM de microscopische diff het meest effectief bij het stellen c.q. uitsluiten van diagnoses? Recentere literatuur lijkt eerder aan te geven dat de microscopische differentiatie niet van doorslaggevend belang is Eigen ervaring de diff behoort nog steeds tot het standaard screeningspakket bij verdenking op neonatale sepsis (alternatieven: CRP, procalcitonine, IL6) Voorlopig door geen andere methoden op te lossen: trombopenie, leukemie, TTP

Perifeer bloeduitstrijkje “het maken van een uitstrijkje” EDTA-ontstold veneus bloed Capillair bloed (vooropwarmen van de handen, ring- of middenvinger (li)) Binnen de 2 uur na afname Horizontaal laten drogen (niet waaien) Direct identificeren …

Perifeer bloeduitstrijkje “waar en hoe kijken?” Ideaal bekijken met een 10 x 50immersie

Wanneer microscopische diff? Kunnen reeds uit de complet volgen Aantal neutro’s < 500/µL, lymfo’s < 500/µL of > 5000/µL (bij 1e staal) Inversie lymfo/neutro en >3900 lymfo’s/µL Mono’s > 1000/µL & plaatjes < 100.000/µL Mono’s > 20% neutro’s > 90% baso’s > 3% Abno WBC scattergram met onvolledige diff Screening of diff?? Q-flags (Sysmex) (left shift / imm gran / L-blast / atyp Ly) Screening bij - MCV < 74 fL of > 110 fL ; - Hb < 7 g/dL (niet-hemato patiënt); - MCHC > 37 g/dL & RBC < 3 milj/µL & Q-flag RBC Agglut Screening bij PLT < 150.000/µL & Q-flag (PLT Clumps)

Wanneer microscopische diff? Het definiëren van de review criteria is sterk gebonden aan de aard van de patiëntenpopulatie en toesteltype Steeds moet het onderscheid gemaakt worden tussen follow-up en initiële stalen (-checks) Beperken: stellen van een minimaal tijdsinterval? ‘screening’ ipv ‘diff’, CellaVision?

CELLAVISION Automatische preclassificatie van een willekeurig aantal WBC, met een pre-interpratie van de RBC en bloedplaatjes, tot 60 uitstrijkjes / uur.

Perifeer bloeduitstrijkje Wat leert een microscopische review? Er bestaan geen richtlijnen die vastleggen wanneer, in het kader van een aangevraagde complet en witte bloedcel differentiatie, een perifeer bloeduitstrijkje bijkomend dient bekeken en geïnterpreteerd te worden door een klinisch bioloog (=review), en niet uitsluitend door een medisch laboratorium technoloog (MLT). In de praktijk gebeurt dit weinig.

Klinisch bioloog vs MLT “Clinical laboratories should produce reports that are useful to clinicians” (ASCP) MLT: ‘hypogranulatie’ KB: ‘uitsluiten MDS’ KB kan ook extra analysen laten uitvoeren (bijv een electroforese of chromatogram bij verdenking op thalassemie ; of bijv een CD4/CD8 bij twijfel over de morfologie van reactieve lymfo’s) KB kan ook testen schrappen

Perifeer bloeduitstrijkje Wat leert een microscopische review? Definitie: review = zorgvuldig microscopisch onderzoek van een gekleurd bloeduitstrijkje, waarbij de klinisch relevante afwijkingen worden genoteerd met een algemene interpretatie samen met de overig beschikbare gegevens (kliniek, biochemisch) TAT: in principe max 72 u. In praktijk meestal binnen de 24 u Voor dringende aanvragen (streng geselecteerd) <2 u

Vaak geziene tekorten bij autom. formules Onvoldoende info over de RBCmorfologie: sikkelcellen, targetcellen, traancellen, fragmentocyten, Howell-Jolly en Pappenheimerbodies. Classificatie van immature granulocyten (de vraag die zich hier stelt is de klinische relevantie?) Detectie van intra- en extracellulaire organismen Onderscheid kleine lymfoblasten (Trombocytenaggregaten)

Vaak geziene tekorten bij manuele formules Identificatiefouten, vooral betreffende maturatiestadia binnen dezelfde cellijn (metamyelocyt vs staaf vs segment) Nood aan preciese omschrijving van het verschil tussen een staaf en een segment (een “draad”verbinding zonder duidelijk nucleair materiaal) Inconsistente commentaren bij afwijkende lymfocytenmorfologie vb: een mantelcellymfoom: atypisch – reactief – gelyseerd Nood aan voorbeelden uit een atlas of database Nood aan preciese criteria voor het opgeven van afwijkingen (zie voorbeeld KUL) Interne QC ronden (maandelijks 2 uitstrijkjes)

Voorstel criteria voor commentaren bij de RBC

Vaak geziene tekorten bij manuele formules Studie KUL 2004 bij 655 patiënten, 352 discrepanties tussen KB en MLT, 125 (WBC), 212 (RBC), 15 blpl WBC 1. Lymfoomcellen: werd 15 maal niet vermeld door de MLT. Het ging hier voornamelijk om lymfoomcellen van patiënten met CLL, zeldzaam een MCL of PLL. Als morfologisch commentaar volgde: gelyseerde WBC of atypische lymfocyt 2. Lymfocyten: wanneer geactiveerd? Vaak niet vermeld (11 maal) of niet correct gerapporteerd (2 maal). 3. Plasmocyten: 4 maal niet vermeld door de MLT. 4. Blasten: Problemen traden op op twee manieren: ofwel werden blasten gemist (hieraan toe te voegen is wel dat het handelde over lage percentages, waarbij enkel bij screening blasten door de KB werden opgemerkt), ofwel (frequenter) werden andere cellen als blast benoemd (telkens zonder contact name met de KB). Twee maal ging het hier om reactieve lymfocyten, één maal om plasmocyten.

Vaak geziene tekorten bij manuele formules Studie KUL 2004 bij 655 patiënten, 352 discrepanties tussen KB en MLT, 125 (WBC), 212 (RBC), 15 blpl WBC 5. Dysplasie: Werd zelden gerapporteerd door de MLT: slechts één maal werd hypogranulatie vermeld. 14 maal werd dit gemist en één maal werd een percentage myelocyten gerapporteerd dat door de Sysmex of KB niet kon bevestigd worden, maar waarbij wel Pelgervormen aanwezig waren. 6. Toxische korreling: 55 maal niet vermeld door de MLT, 1 maal gerapporteerd bij een CML, terwijl de KB dit niet vermeldt. Eén maal vermeld door de MLT, terwijl de KB juist hypogranulatie vermeldt. 7. Basofilie: 2 maal werd een basofilie niet geteld door de MLT (rapportage door KB van 4% en 5% basofielen).

Vaak geziene tekorten bij manuele formules Studie KUL 2004 bij 655 patiënten, 352 discrepanties tussen KB en MLT, 125 (WBC), 212 (RBC), 15 blpl RBC 1. Geen morfologische beoordeling van de rode reeks, terwijl de KB anisopoikilocytose vermeldt: 42 maal. 2. Hypochromasie: wordt 8 maal door de MLT gerapporteerd, terwijl het MCH normaal is en de KB dit niet vermeldt. Zes maal vermeldt de KB polychromasie en de MLT hypochromasie. 3. Polychromasie: wordt in tegenstelling tot hypochromasie ondergerapporteerd (37 maal niet vermeld). 4. Microcytose: aantal malen gerapporteerd met normaal MCV. Vaak wordt naast microcyten ook anisocytose vermeld (is dit wel nodig?) Ook wordt niet altijd de aanwezigheid van sferocyten herkend, vaak worden deze benoemd als microcyten. 5. Anisocytose: vaak niet vermeld (20 maal). 6. Poikilocytose: Bij uitgesproken poikilocytose wordt deze niet gerapporteerd ( 23 maal).

Vaak geziene tekorten bij manuele formules Studie KUL 2004 bij 655 patiënten, 352 discrepanties tussen KB en MLT, 125 (WBC), 212 (RBC), 15 blpl RBC 7. Fragmentocyten: 12 maal werden fragmentocytenexcessen gemist (dit varieerde van licht tot zeer sterk). Twee patiënten met een sterk exces werden nooit gerapporteerd. 8. Pappenheimerbodies (2 maal niet vermeld) en Howell-Jolly bodies (1 maal te veel vermeld). Basofiele stippeling werd 6 maal niet vermeld. 9. Erythroblasten: 5 maal niet vermeld (enkel bij screening waargenomen door KB), 1 maal sterk dysplastische erythroblasten, maar vermelding: geen morf. Comm. 1 maal vermeldt de MLT 1% normoblasten, maar de KB schrijft: normaal perifeer bloed. 10. Rouleaux vorming: 7 maal niet vermeld. 11. Agglutinatie: 2 maal niet vermeld.

Vaak geziene tekorten bij manuele formules Studie KUL 2004 bij 655 patiënten, 352 discrepanties tussen KB en MLT, 125 (WBC), 212 (RBC), 15 blpl Bloedplaatjes Aggregaten: 7 maal niet vermeld door de MLT. 2. Macrobloedplaatjes waardoor vals lage aantallen: 6 maal niet vermeld.

Aandachtspunten naar MLTs die hematocytomorfologisch onderzoek uitvoeren Indien er talrijke gelyseerde cellen aanwezig zijn van lymfatische origine, pas dan op voor CLL / NHL Zeker indien patiënt ouder (dan 16j) en er een absolute en relatieve lymfocytose is.

CLL

SLVL

Aandachtspunten naar MLTs die hematocytomorfologisch onderzoek uitvoeren Hypersegmentatie Definitie is omstreden >3% PMN met > 5 lobben >20% PMN met > 5 lobben >3% PMN met > 5 lobben of > 2% PMN met > 6 lobben of > 1% PMN met > 7 lobben

Megaloblastaire anemie

Let op de aanwezigheid van reactieve lymfocyten Aandachtspunten naar MLTs die hematocytomorfologisch onderzoek uitvoeren Let op de aanwezigheid van reactieve lymfocyten Vooral bij kinderen Differentieer van de grotere normale lymfocyt

Mononucleosis Infectiosa

Mononucleosis Infectiosa

Aandachtspunten naar MLTs die hematocytomorfologisch onderzoek uitvoeren Onderscheid acantocyten vs echinocyten

Aandachtspunten naar MLTs die hematocytomorfologisch onderzoek uitvoeren Kijk steeds naar leeftijd, in het bijzonder uitstrijkjes van neonati zijn globaal verschillend, in het bijzonder zijn macrocyten normaal aanwezig, naast evt. erytroblasten tijdens de eerste levensweek

Aandachtspunten naar MLTs die hematocytomorfologisch onderzoek uitvoeren Pas op met uitstrijkingsartefacten Traancellen - Geldrolvorming

“Heilige hoorns” in het paleis van Knossos van Koning Minos in Kreta “Kerat” = hoorn

Ontstaan van keratocyten, helmcellen of hoorncellen “blister” cell “keratocytes” Figure 3. Phase contrast photomicrographs demonstrating successive stages of formation of keratocytes in the blood (from Bessis M: Blood Smears Reinterpreted, Springer-Verlag, 1977, p. 85). Van belang bij DIC, neoplasie (veranderde microvasculatuur), …..

Aandachtspunten naar MLTs die hematocytomorfologisch onderzoek uitvoeren Let op de aanwezigheid van fragmentocyten, maar let ook op voor overdiagnose (< 0.2% is normaal) ‘echte’ schizocyt Microsferocyt wordt ook als schizocyt weerhouden Helmcellen of keratocyten

Aandachtspunten naar MLTs die hematocytomorfologisch onderzoek uitvoeren Onderscheid Howell Jolly en Pappenheimer body

Aandachtspunten naar MLTs die hematocytomorfologisch onderzoek uitvoeren Het vermelden van trombocytenaggregaten is enkel klinisch significant indien er zeer grote aggregaten zijn en indien er een verlaagd aantal bloedplaatjes werd geteld Macrotrombocyten enkel vermelden indien er meer grote dan kleine bloedplaatjes aanwezig zijn waarbij een beïnvloeding van de telling wordt verwacht.

Leeftijd! Referentiewaarden Hgb MCV Telling MCH hct Geboorte 14.5-22.0 95-125 3.9-5.5 31-37 46-60 1e week 14.0-22.0 90-120 3.9-6.3 42-64 2e week 12.5-20.0 86-120 3.6-6.2 28-40 39-63 1e maand 11.0-18.0 85-120 3.0-5.4 35-55 2e maand 10.0-13.5 80-115 2.7-4.9 26-34 30-42 3-6 maand 75-105 3.1-4.5 25-35 0.5-2 jaar 10.5-13.5 70-86 3.7-5.3 23-31 2-6 jaar 11.0-14.0 73-85 3.9-5.3 24-30 33-42 6-12 jaar 11.5-15.5 77-95 4.0-5.2 25-33 35-45

Referentiewaarden Reticulocyten % X 109/L Erytroblasten Navelstreng 3-7 110-450 0-1.0 Dag 1 0-0.5 Dag 3 1-3 50-150 0-0.01 Dag 7 0.1-2 10-100 > 1 week

Referentiewaarden Totaal aant. neutro’s 0-60 h 2.9-14.5 61-120 h 1.8-7.2 5-28 d 1.8-5.4 1-6 m 1.0-8.5 0.5-8 j 1.5-8.0 8-16 j 1.8-8.0 Immature neutro’s 0-1.4 0-0.6 0-0.5 Imm/tot neutro’s < 0.16 < 0.13 < 0.12 Imm/mat ratio 0-1 m ≤ 0.3

Referentiewaarden Lymfocyten Geboorte 2.0-11.0 12 h 24 h 2.0-11.5 2.0-17.0 1 m 2.5-16.5 6 m 4.0-13.5 1 j 4.0-10.5 2 j 3.0-9.5 4 j 2.0-8.0 6 j 1.5-7.0 8 j 1.5-6.8 10 j 1.5-6.5 16 j 1.2-5.2

Enkele voorbeelden

.

Chédiak-Higashi syndroom

Congenitale sferocytose

pyruvaate kinase deficiëntie milde anemie met anisocytose, macrocytose, polychromasie en NRBC. PK is een enzyme van de glycolytische pathway die voor energie moet zorgen in de RBC. PK deficiëntie is een heterogene groep van ziekten tgv verschillende mutaties in het PKgen. Overerfbaarheid is autosomaal recessief. Er is een opflakkering van de anemie in het kader van infecties

.

De meest voorkomende vorm van congenitale hemolytische anemie is de glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) deficiëntie die miljoenen mensen wereldwijd aantast. Meestal slechts met een intermittente hemolyse naar aanleiding van infecties of het eten van bijv. bonen of innemen van medicaties (algemeen tgv een oxidatieve stress. We zien hier schizocyten (rode pijltjes) en hemighosts (blauwe pijltjes). Het betreft een X-gebonden recessieve erfelijke aandoening. .

glucose-6-fosfaat dehydrogenase (G6PD) deficiëntie Blauw pijltje: keratocyt Rood pijltje: hemighost In dit kader wordt het ontstaan van keratocyten beschreven tgv het uitpitten van Heinz lichaampjes in de milt. Dus een supravitale kleuring kan hier nuttig zijn

SCA

Lymfoblasten

Pseudopelgerisatie bij MDS

Döhle bodies

Patiënt met uitgebreide brandwonden

Externe QC WIV-LP HEMATimage Met dank aan Bernard Chatelain die een evolutie richting elektronische QC ondersteunt (coordinatie Dr Marianne Van Blerk) HEMATimage met dank aan Joel Corberand (Toulouse) die een internationaal georiënteerd aanbod biedt voor elektronische QC

Externe QC HEMATimage Inscription / Renseignements administratifs et techniques MEDICINim@ge FCBM 66 chemin du Vallon 31400 TOULOUSE - FRANCE Tél : 05.62.17.39.35 - Fax : 05.62.17.39.01 Email : secretariat.fcbm@adimep.com

Referenties Blood Cells: A Practical Guide [ILLUSTRATED] (Hardcover) by Barbara Bain "Performing an accurate blood count and correctly interpreting a blood film require that an appropriate sample from the patient, mixed with the correct amount of..." (more) Key Phrases: Clin Pathol, Clin Lab Haematol, Acta Haematol (more...) (1 customer review)     List Price:$145.00 Price:$145.00 & this item ships for FREE with Super Saver Shipping. Details Availability: In Stock. Ships from and sold by Amazon.com. Gift-wrap available.

Referenties Samenvatting en aanbevelingen werkgroep “microscopische differentiatie” www.de-vhl.nl/documents/samenvattingwerkgroepmicdiffVHLvs05.pdf - Critically appraised topic: Review microscopisch onderzoek perifeer bloed door de klinisch bioloog (Dr. Kristien Van Pelt) http://www.uzleuven.be/uzroot/hosting/labo/Leermodule/EBLM/EBLM_LM_CAT/2004-2005/Documenten/CAT_20050531_ReviewHematoMicroscopie.pdf Kwaliteitshandboek, lab klinische biologie, UZ Gent

Dank voor uw aandacht