BRCA diagnose bij familiale borstkanker

Aantal borstkankers per jaar Borstkanker bij vrouwen: 9.489 Eierstokkanker: 909 Borstkanker bij mannen: 67 (bron: Nationaal Kanker Register, 2006) EIERSTOK- KANKER

Kanker – Familiale kankers kanker is het gevolg van somatische mutaties de meeste kankers zijn sporadisch (toevallig) borst- of eierstokkanker treft één vrouw op 10 bij 10% is er een familiale geschiedenis van borst- of eierstokkanker kanker zelf is niet erfelijk, sommigen erven een genetische voorbeschiktheid om kanker te ontwikkelen

Borstkankergenen: BRCA1 en BRCA2 Kans op borstkanker bij BRCA1/2 mutatie Leeftijd Algemeen BRCA1/2 35 jaar 3/1000 1/100 45 jaar 3/10 55 jaar 3/100 5/10 85 jaar 1/10 8/10 2 grote genen: BRCA1 (op chromosoom 17): 7.094 baseparen (1863 aminozuren) BRCA2 (op chromosoom 13): 10.390 baseparen (3418 aminozuren) Het onderzoek is complex en daarom voorbehouden aan familiale gevallen.

BRCA1

BRCA2

Sanger sequencing Sequencing - ddNTP

Gen – Exon – PCR - Sequencing

BREAST AND OVARIUM CANCER Three or more familial cases Unselected cases ? 20-25 % BRCA1 5-10 % BRCA1/2 10-15 % BRCA2

Risico’s op borstkanker

Indicaties voor mutatie-analyse Goede selectie van families  3 aangetasten (en sommigen < 50) families met  2 BRCA +  1OVCA families met  3 BRCA onder 50 j 2 eerstegraadsverwanten met  2 CA onder 50 j families met borst-en ovariumcarcinoom (BRCA1) families met borstcarcinoom bij mannen (BRCA2) borstkanker < 30j (ook bij unieke casus) minimum 1 aangetaste persoon in leven

Moleculaire diagnostiek Diagnostische test Predictieve of presymptomatische test

? eierstok borstkanker prostaatkanker ? kanker ? borstkanker 40 j

Predictieve genetische test Familiale BRCAX mutatie is gekend Genetische test bij niet aangetaste verwant raadpleging geneticus voor medische informatie counseling bij psycholoog bloedname voor analyse (+bespreking van risico’s) raadpleging geneticus voor bespreking resultaat bespreking praktische aspecten van opvolging organisatie van psycho-sociale follow-up

Predictieve genetische test Multidisciplinair team - gynecologie/gynecologische oncologie/ sinologie/heelkunde/plastische chirugie - klinische genetica/sociale verpleegsters - psychologen/psychiatrie

Borstkankeronderzoek CME - UZLeuven 2058 families  patiënten (DNA) onderzocht: ≈ 2300 families met mutaties in BRCA1/2: 277 gezonde familieleden onderzocht: 857   Aantal predictieve testen per jaar:

Predictieve genetische test Follow-up bij positieve test: psycho-sociale counseling profylaxie bij negatieve test: terugval op bevolkingsrisico

Probleemsituaties Geen familiale mutatie gekend beleid baseren op statistische risico’s computer programmas, tabellen van Claus. http://www.isds.duke.edu/~gp/brcapro.html Mutatieanalyse is tijdrovend Informatiedoorstroming in familie bij at risk individuen Geen predictieve BRCAX testen zonder toestemming en bij minderjarigen

40y no mut in BRCA1 37y p.M1V in BRCA1 c.7265 del A in BRCA2 I.1 I.2 III.1 III.2 40y no mut in BRCA1 III.3 37y p.M1V in BRCA1 III.4 c.7265 del A in BRCA2

Massive parallel sequencing Roche GS FLX (454 Life Sciences) 250 bp (450 bp) per fragment 100.000.000 bp (500.000.000 bp) per run (8 h) 12-15 Gb of data per run Illumina Genome Analyzer II (Solexa) - HiSEQ Applied Biosystems SOLiD 3 (Agencourt) 25-35 bp per fragment 1 to 6.000.000.000 bp per run (days-weeks) 1-10 Tb of data per run First introduced in 2005 NEXT GENERATION SEQUENCING

BRCA onderzoek op het ‘NEXT GENERATION SEQUENCING’ platform volledige BRCA1 en BRCA2 sequencing analyse voor 40 (eventueel 80) patiënten in één run Voordelen hogere capaciteit beperking van wachttijden lagere kost per patiënt Uitdaging snelle data-analyse

gDNA sstDNA library Genome fragmented by nebulization DNA fragments are treated so that they can be retrieved and further processed The aim is to obtain the sequence of individual fragments after which the sequence data will be assembled again. The problem is that millions of these fragments are present in a solution – so you need ways to isolate them and then to amplify them in such a way that they become readable. Single molecule, and there are no means today to determine or even identify such an individual fragment, let alone to do it a million times. Genome fragmented by nebulization sstDNA library created with adapters A/B fragments selected using streptavidin-biotin purification

Clonally-amplified sstDNA attached to bead DNA polymerase dNTPs You should realize that eventually, between 500.000 and a million fragments will be sequenced in one run. Size of the beads: 28 µm PCR in mayonnaise ~106 microreactors per ml All processed in parallel Anneal sstDNA to an excess of DNA capture beads Emulsify beads and PCR reagents in water-in-oil microreactors Clonal amplification occurs inside microreactors Break microreactors, enrich for DNA- positive beads sstDNA library Clonally-amplified sstDNA attached to bead

Anneal single-stranded library DNA molecules to capture beads. Distribute millions of beads in thermo-stable water-in-oil emulsion. Microreactors contain complete amplification mix. Thermocycle. Isolate and purify only beads with amplified DNA.

75 picoliter volume wells 480 wells/mm2 1,600,000 wells per 60 x 60mm Load beads into PicoTiterPlateTM Well diameter: average of 44 µm A single clonally amplified sstDNA bead is deposited per well. DNA beads packed into wells with surrounding beads and sequencing enzymes. 400,000 reads obtained in parallel on large format PicoTiterPlate device 75 picoliter volume wells 480 wells/mm2 1,600,000 wells per 60 x 60mm ≈ 44 µm

Method has been improved by other laboratories, e.g. deletion testing http://www.myriad.com/ Cost: $ 2480 (approx. € 2100 or £ 1400) (€ 3980 if purchased via Bioscientia) Licenses ? $15.000 plus $50/test for a test of 5 mutations, $150 for 6-20 mutations Method has been improved by other laboratories, e.g. deletion testing

Matthijs G. The European opposition against the BRCA gene patents. Familial Cancer. 5:95-102 (2006)

District Court, New York Patients and professional societies BRCA1/BRCA2 gene patents invalidated Judge R. Sweet District Court, New York 152-page decision Patients and professional societies March 28, 2010

Risk of breast cancer for relatives with BRCA1 or BRCA2 mutations .2 .4 .6 .8 Cumulative breast cancer incidence 20 40 60 80 30 50 70 Breast cancer Age .02 .20 .37 .55 .71 .82

Risk of ovarian cancer for relatives with BRCA1 or BRCA2 mutations .02 .21 .40 .46 .54 BRCA1 .02 .02 .06 .12 .23 BRCA2

Risk of breast cancer for relatives with BRCA1 or BRCA2 mutations by birth cohort 20 40 60 80 30 50 70 Age Cumulative breast cancer incidence .2 .4 .6 .8 1.0 born < 1940 born > 1940

Age at breast cancer diagnosis among probands with BRCA mutations by physical activity as a teenager, adjusted for birthyear