MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE Principe: In de spectrofotometrie wordt de concentratie van een gekleurde stof bepaald door de kleur dan de oplossing van die stof te vergelijken met oplossingen waarin diezelfde gekleurde stof zit maar dan in concentraties die bekend zijn. De kleur kan afkomstig zijn van de stof zelf maar kan ook het reactieproduct zijn van de te meten stof met een geschikt reagens. Concentratie van een onbekende kan al met het blote oog geschat worden Sneltesten: indicator strips (bijvoorbeeld voor aquaria: nitraat, nitriet, ...) Nauwkeurige meting: met spectrofotometer Oplossing heeft een kleur omdat het een gedeelte van het licht absorbeert

MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE LICHT = elektromagnetische golven WAT IS LICHT ? Naargelang de energie-inhoud van deze golven wordt het elektromagnetisch spectrum opgesplitst in :  Gammastraling (behandeling van kanker)  X-stralen (geneeskunde)  Ultraviolet stralen  Zichtbaar licht  Infrarood stralen  Microgolven (microgolfovens)  Radiogolven (F.M. radio, radar, televisie) veel energie weinig energie

MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE Enkel een klein deel van het elektromagnetisch spectrum is voor de mens zichtbaar als kleur. Dit is dan het zichtbare gedeelte. WAT IS LICHT ? In dit zichtbare deel van het spectrum kunnen we 7 basiskleuren onderscheiden (dit zijn de kleuren van de regenboog): Rood, Oranje, geel, groen, blauw, indigo en violet.

MOLECULAIRE SPECTROFOTOMETRIE Ultra Violet (UV) 200 - 400 nm Zichtbaar (Visible - Vis) 400 - 800 nm Nabij Infra Rood (NIR) 800 - 2500 nm Infra Rood (IR) 2500 - 12500 nm

Electromagnetische golven Licht is een elektromagnetisch golfverschijnsel dat zich in vacuum met een constante snelheid (c) van ca. 300 000 km/s voortplant. Een golf kunnen we karakteriseren met: De trillingstijd T: de tijdsduur van een trilling (eenheid: s) De frequentie f: het aantal trillingen per seconde (eenheid: Hz) (f=1/T). De golflengte l: de lengte van een trilling (eenheid: nm (10-9 m) of Å (10-10 m)) Het golfgetal s:1/ l (eenheid: cm-1) - wordt voornamelijk in de Infra Rood spectroscopie gebruikt de golfsnelheid:  c = (afgelegde weg / tijd) = l / T = f . l  (f=1/T). als de golflengte toeneemt neemt de frequentie af en vice versa.  Electrisch veld Magnetisch veld

Kleurencirkel en kleurenspectrum als we uit wit licht de kleur groen verwijderen: geeft rode kleur . We zien steeds de complementaire kleur liggen tegenover elkaar in het kleurenspectrum

Licht als energie De wet van Planck E = h . f = h.c/l De intensiteit van een bundel licht is een maat voor de hoeveelheid energie. Deze bundel bestaat uit een stroom energiedeeltjes. Deze deeltjes worden KWANTEN of FOTONEN genoemd. De wet van Planck De energie inhoud van elk deeltje is evenredig met de frequentie. Dit wil zeggen dat een bundelstraling met een frequentie f bestaat uit fotonen met een energie gelijk aan : E = h . f = h.c/l  Hierin is h = de constante van Planck = 6,625 x 10-34 J.s

Interactie tussen materie en straling Materie getroffen door electromagnetische straling: De straling wordt doorgelaten: fotonen passeren ongehinderd De straling wordt verstrooid: fotonen veranderen van richting De starling wordt geabsorbeerd: fotonen worden door het medium opgenomen Energie van het medium zal stijgen met de energieinhoud van de fotonen E2= E1 + hf

Moleculaire energieniveaus Veel meer vrijheidsgraden dan een atoomkern+electronen Buig, strek, rotatie-modes met eigen gequantizeerde energieniveaus Kleine energieverschillen ! dichte `bosjes’ van lijnen, voornamelijk IR De opgenomen energie kan gebruikt worden ter verhoging van: Rotatie energie:snelheid waarmee een molecule draait om zijn as Vibratieenergie: trillen van de atomen in een moleculen Electronen energie: energie die de electronen bezitten in hun banen om de atoomkern Etot= Eelc + Evib + E rot Eelec >> Evib >> Erot VIS IR micro

Energie Aangeslagen toestand E3=hf3=h.c/l3 E2=hf2=h.c./l2 Grond toestand Electronen In grond toestand Vibrationele niveaus Rotationele niveaus

Spectrofotometrie I0 = Ia + It + Ir Indien men er voor zorgt dat Ir = 0 door bv. een blanco te gebruiken en te zorgen dat de reflectie geminimaliseerd wordt dan is de bovenstaande vergelijking gelijk aan : I0 = Ia + It

De wet van Lambert invloed van de vloeistofdikte (cuvette lengte) ten opzicht van de intensiteit van de lichtstraal. de intensiteit van de uittredende lichtstraal t.o.v. de vloeistofdikte vertoont een exponentieel dalende kurve. Waarin k een constante is en b de dikte van de vloeistoflaag It Procentuele transmissie transmissie b Absorptie Dan wordt

Wet van Beer Naar analogie van de bovenstaande afleiding van de wet van Lambert kan men de wet van Beer bepalen. Hierin wordt de absorptie bestudeerd i.f.v. de concentratie van de oplossing waardoor men licht gaat zenden. Men bekomt eveneens een exponentieel dalende kurve met volgende formule : It = I0 . 10 – k2.C Verdere analoge afleiding leert ons dat de absorptie in een oplossing rechtevenredig toeneemt met stijging van de concentratie in de oplossing of : A = k2 . C It C

Wet van Lambert-Beer Indien men de wet van Lambert en Beer samenvoegt kan men stellen dat : A = k . b A = k2 . C Of dat A =k. k2 .b. C A = ε .b. C ε = molaire absorptiecoefficient (L/(mol.cm)) b= dikte van de cuvette c= concentratie in mol/L De wet van Lambert-Beer geldt alleen als aan de volgende voorwaarden wordt voldaan: monochromatisch licht "optisch lege" vloeistoffen (geen lichtverstrooiende deeltjes aanwezig) constante temperatuur niet te geconcentreerde oplossing

Opnemen van absorptiespectrum Manueel of automatisch (in nieuwere toestellen) 2 oplossingen: blanco (bevat alles behalve de te meten stof) Standaard met hoogste concentratie Voorbeeld: Fe2+ + fenantroline geeft rood complex dus absorbeert tussen 480 en 550nm we nemen het spectrum op tussen 450 en 600nm l A 450 0,07 470 0,1 490 0,17 510 0,22 530 0,25 550 570 0,21 590 0,14 610

Doel = Concentratiemetingen Calibratiemethode: ijklijn Van de te bepalen verbinding wordt een serie (nauwkeurig bekende!) verdunningen gemaakt, waarvan de absorpties worden gemeten. Door gebruik te maken van interpolatie kan de concentratie van een onbekend monster na meting van de absorptie worden berekend A4 A3 A2 A1 y = ax + b Ax C1 C2 C3 C4 Cx

Concentratiebepaling: praktisch voorbeeld Fe met fenantroline Welk concentratiegebied: rekening houden met lineair gebied (uit literatuur): tot 10 mg/L Maak stockoplossing van 0.5g/L=500 mg/L Hieruit maken we verdunningen : 0mg/L, 1mg/L, 2mg/L, 3mg/L, ....10mg/L en meten de absorbantie Concentratiebepaling: Meet Absorbantie van onbekende oplossing Kunnen gemiddelde ε bepalen uit de standaarden en deze gebruiken in de berekening Kunnen ijkrechte opstellen en concentratie van onbekende berekenen uit vergelijking

Instrumentatie intreespleet uitlezing uittreespleet detector lichtbron golflengteselectie versterker cuvet

stralingsbron De Stralingsbron moet van constante stralingsintensiteit zijn en straling uitzenden zo gelijkmatig mogelijk over het gehele golflengtegebied verdeeld. Meestal gebruikt men voor het zichtbare gebied een wolfraam lamp die een continue spectrum heeft van 350 - 2500 nm. Een Deuteriumlamp met een hoge intensiteit tussen 180 nm en 375 nm Deze lamp wordt in het U.V. gebied gebruikt.

Golflengteselectie Filters of monochromators worden gebruikt om de door de bron uitgezonden straling te scheiden in zijn samengestelde golflengtes. Monochromatisch licht nodig voor: Grotere selectiviteit Betere gevoeligheid Zekerheid dat aan wet Lambert-Beer voldaan wordt Voor de golflengteselectie kunnen: Filters (absorptie of interferentiefilters) Monochromators: prismas en roosters

Filters Absorptiefilters Dit zijn filters die een deel van het lichtspectrum doorlaten en een ander deel tegenhouden door absorptie. Ze bestaan uit gekleurd glas of uit een organische kleurstof gesuspendeerd in gelatine en vastgehouden tussen glazen plaatjes. Ze hebben een effectieve bandbreedte van bv. 20 nm dwz dat bv. een filter van 500 nm eigenlijk alle golven doorlaat tussen 490 nm en 510 nm Interferentiefilters Deze zijn gebaseerd op optische interferentie, reflectie en uitdoving. Ze hebben een kleinere bandbreedte dan de absorptiefilters

MONOCHROMATORS: Prisma Lichtstralen worden gebroken bij de overgang van lucht naar glas (wet van Snellius) (n=brekingsindex) Breking is golflengteafhankelijk: hierdoor krijgen we dispersie van licht Een lens focuseert het uittredend licht naar de uittreespleet Door het prisma te draaien kan men de gewenste golflengte selecteren Wet van Snellius

Monochromator: rooster Rooster of tralie op regelmatige afstand van elkaar (vb. krassen op een glazen plaat (zo als een CD) Parabolische spiegel richt wit licht op het rooster Licht van verschillende golflengtes wordt weerkaatst onder een andere hoek 2de spiegel richt het weerkaatst licht op de uittreespleet Door de tralie te draaien selecteert men de golflengte

monochromator Een monochromator zal de lichtstraling scheiden volgens de golflengte en zal om het even welk deel van de straling doorlaten. Alle licht gaat dus door heen de monochromator. Er zal dus niet geselecteerd worden door absorptie zoals bij filters.

cuvetten Kuvetten zijn de recipiënten die gebrukt worden om de oplossingen te meten in de spectrofotometer. Er bestaan talrijke uitvoeringen naargelang het gebruik. Kuvetten kunnen gemaakt zijn uit glas, kwarts of kunststof. Kwartskuvetten worden gebruikt voor het werken in het UV-gebied, hoewel heden ook kunststofkuvetten uit bv. metacrylaat kunnen gebruikt worden Naargelang het volume kan men kuvetten van verschillende inhoud en weglengte gebruiken. De meest gebruikte weglengte is één cm en het meest courante volume is 3,5 ml en 1,5 ml. Een kuvet heeft meestal twee gepolijste of heldere zijden en twee matte zijden, doch voor bv. fluorimetrie moet men kuvetten gebruiken met vier gepolijste zijden.

detector De stralingsdetector (bv fotocel) zet de erop vallende straling om in een elektrisch signaal dat na versterking wordt gemeten. Van de detector wordt vereist: - een hoge gevoeligheid voor een groot golflengtegebied - een rechtlijnig verband tussen de intensiteit van de lichtstraling en het daardoor opgewekte elektrische signaal. De versterker moet een lineaire afhankelijkheid tussen invoer en uitvoer bezitten. De meter geeft het gemeten signaal aan op een transmissie schaal (%) en/of extinctie schaal (log-schaal).

Fotocel: cylindrisch glazen omhulsel met fotogevoelige kathode en anode.Lichtinval rukt electronen los uit kathode die worden aangetrokken door de kathode waardoor een stroom ontstaat Fotovermeningvuldigingsbuis: een fotogevoelige kathode en 10 anodes op verschillend potentiaal: geeft een belangrijke versterking van het signaal

uitlezing De meetresultaten van een spectrofotometrische bepaling worden zowel analoog als digitaal geregistreerd kan ze zowel als een absorptie A of Procentuele Transmissie % T aflezen. Ook kan men bij een aantal spectrofotometers rechtstreeks concentraties aflezen mits men de richtingscoëfficiënt ( de molaire absorptiecoëfficiënt ) kent en in het apparaat vastlegt.

Spectrofotometrische titratie spectrofotometer recorder Automatische buret Papier loopt met constante snelheid (cm/min) In plaats van een cuvet meetcel (1cm) ondergedompeld in de oplossing Titreren met constante debiet (ml/min)

Spectrofotometrische titratie van azijn CH3COOH FFT kleurloos NaOH roos-paars Eindpunt van de titratie Bepaling absorptiespectrum FFT in zuur en basisch midden A A Bepaling werkgolflengte l l zuur basisch CH3COOH + NaOH CH3COONa + H2O