Flow cytometrie bij lage cytoses in lumbaal vocht Veerle Compernolle Supervisor: Nancy Boeckx

Principe van Flow Cytometrie Stream of fluid containing antibody-labeled cells Fluorescence detectors Side scatter Laser Forward scatter

Onderwerp van critical appraised topic = Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op cerebrospinaal vocht

Onderwerp van critical appraised topic = Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op vochten Identificatie van een receptor of een membraan- of cytoplasma- of nucleair antigeen van hematopoïetische cellen, exclusief de antigenen van het HLA systeem Beperking: De verstrekkingen 555730-555741 en 555752-555763 mogen enkel worden aangerekend aan de ZIV voor het typeren van hematologische maligniteiten, of in geval van congenitale of levensbedreigende verworven immunodeficiënties, of in geval van sarcoïdose.

Onderwerp van critical appraised topic = Immunofenotypering Diagnostisch & MRD op vochten Voornamelijk: Opsporen metastasen van hematologische maligniteiten in cerebrospinaal vocht

Klinische gegevens bij aanvraag

Belang opsporen hematologische metastasen in cerebrospinaal vocht Prognostisch Intensificatie van de therapie Intrathecale chemotherapie & Radiotherapie Nevenwerkingen: oa. -secundaire maligniteiten -verminderde cognitieve capaciteit -groeiretardatie...

Laboratory and imaging findings in patients with leptomenigeal carcinomatosis (ref. Grossman et al. Cancer treatment reviews, 1999: 25:103-119) Diagnostic test Abnormal finding % of patients with abnormal findings Lumbar puncture Elevated CSF protein Elevated CSF pressure Low CSF glucose Positive CSF cytology on initial lumbar puncture Positive CSF cytology after three lumbar punctures 75% 50% 40% 85% Neuro-imaging studies Abnormal findings 50%

Laboratory and imaging findings in patients with leptomenigeal carcinomatosis (ref. Grossman et al. Cancer treatment reviews, 1999: 25:103-119) Diagnostic test Abnormal finding % of patients with abnormal findings Lumbar puncture Elevated CSF protein Elevated CSF pressure Low CSF glucose Positive CSF cytology on initial lumbar puncture Positive CSF cytology after three lumbar punctures 75% 50% 40% 85% Gouden standaard Neuro-imaging studies Abnormal findings 50%

Gouden standaard: cytologie Sensitiviteit: 50-70% Goede specificiteit 1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde? -het aantal vals negatieve resultaten verminderen? -Quid specificiteit? 2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal

Overzicht van uitgevoerde en geannuleerde stalen (2002-2003) (cellen/µl)

Vragen 1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde? -het aantal vals negatieve resultaten verminderen? -Quid specificiteit? 2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal 3. Zijn deze annulaties terecht? Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol?

1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde?

Guidelines: “Flow cytometrische immunofenotypering van cerebrospinaal vocht kan klinisch nuttig zijn bij patiënten met een vermoeden van maligne lymfomen of leukemie”

Validiteit studies Fernandez Moriarty Urbanits Valdez Roma Subira French Finn Geen Cytologie Referentietest Klinische F.U. Nee Ja Ja ? Ja nvt ? Ja ? Referentietest Onafh+blind? Nee nvt ? Ja 2x niet Ja 2x niet Referentietest steeds uitgevoerd? ? CNS invasie ? ? Ja CNS invasie ? Test onafh. van andere info uitgevoerd Ja Validatie in 2° onafh groep? Nee

Patiëntenspectrum

Fernan- dez Urbanits Subira French Roma Finn Aantal patiënten 43 31 51 18 32 Aantal CSV-stalen 53 168 352 36 31 35 -totaal -Valide cyto+IF 51 168 291 25 27 23 -Concordante 40 78% 158 94% 283 97% 17 68% 19 70% 13 69% negatief 28 147 269 11 14 9 positief 12 11 14 6 5 4 -Discordante 11 9 8 5 8 3 Cyto+/IF- 2 3 1 * + 1 * + 1 1 1 Cyto-/IF+ 9 6 2 * + 1 * 3 7 2 -Onduidelijk 1 3 6 Cyto?/IF- 3 5 Cyto-/IF? 1 1

Aantal stalen Sensitiviteit Specificiteit Prevalentie Cyto IF Cyto IF Roma et al. 0,412 51 0,57 1,00 0,93 1,00 Subira et al. 0,102 167 0,65 1,00 0,98 1,00 Urbanits et al. 0,485 27 0,46 0,92 1,00 1,00 Sensitiviteit/specificiteit werd berekend -met ‘klinische follow-up’ als gouden standaard -met gebruik van aantal stalen

Concordante en discordante data Resultaten 2002-2003 Concordante en discordante data Concordant Discordant Twijfel Negatief Positief Cyto + IF- Cyto- IF+ 16 7 1 2 4 77%

Concordante en discordante resultaten in functie van de cytose (cellen/µl)

1. Heeft immunofenotypering van CSV door flow cytometrie een aanvullende waarde? Besluit Er is een grote concordantie tussen immunofenotypering en cytologisch onderzoek Combinatie van immunofenotypering en cytologisch onderzoek kan het aantal vals negatieve resultaten verminderen. De specificiteit van immunofenotypering dmv flow cytometrie is zeer goed

Houding t.o.v. discordante resultaten? Quid: Negatief (of twijfelachtig) resultaat bij cytologie en positieve immunofenotypering Hematologie: Beschouwen als positief resultaat. Aanpassen therapie Pediatrische hemato-oncologie: geen aanpassing therapie.

2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal? - Geen anticoagulans; geen fixatie OK - Onmiddelijk transport naar labo - Beschikbare klinische of diagnostische informatie moet samen met het staal opgestuurd worden - Bewaring op kamertemperatuur OK - Analyse binnen de : -3 uur (Subira) -8 uur (Australasian group) -24 uur (Finn) Stalen worden soms pas na 24 uur geanalyseerd!

2. Wat zijn de condities voor een geschikt staal? -Lysis van erythrocyten door externe lyserende reagentia is aanvaardbaar Globaal voor immunofenotypering: Idealiter: 500000-1000000 cellen per tube. Bij cytose van 50 cellen/µl: 10 ml nodig !!! Ideale aantal cellen wordt dus zelden gehaald.

3. Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol? Guidelines -“There is a strong consensus among all conference participants that every attempt should be made to derive useful information from any specimen submitted for analysis.” -Flagging criteria intrinsiek aan staal: hypocellulariteit (US-Canadian Consensus)

3. Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol? -Welke verwerpingscriteria worden gehanteerd in originele studies? -Is het detecteren van zeer kleine aantallen blasten/lymfoomcellen zinvol?

Vooraf gestelde verwerpingscriteria Achteraf gestelde verwerpingscriteria Roma Lymfoom+ leukemie Onvoldoende events aanwezig. Aantal wordt niet gespecifiëerd Subira Leukemie -RBC aanwezig -<1ml Fernandez ALL Finn Vnl lymfoma Geen <200 events in diagn popul. >24 uur oud OF <10000 cellen (in totaal) Urbanits lymfoma -<1ml -<1000 cellen French Varia -talrijke RBC aanwezig -<1000 cellen+<20% lymfo’s -<5 cellen op cytospin ->3 dagen oud

Resultaat immunofenotyperingen bij lymfomen in functie van de cytose (cellen/µl)

Resultaat immunofenotyperingen bij leukemie in functie van de cytose (cellen/µl)

Is het opsporen van kleine aberrante populaties zinvol ? Leukemie CNS leukemie wordt meestal gedefiniëerd als de aanwezigheid van leukemische blasten (na cytocentrifugatie) in cerebrospinale vochten met meer dan 5 leukocyten per microliter. Klinisch belang van blasten bij cytose<5/µl is onduidelijk.

Gilchrist et al.: geen verhoogd risico voor CNS-relapse of andere relapse dan CNS-negative patiënten. (ALL) Tubergen et al. : De ‘disease free survival’ is na 5 jaar niet verschillend. Bürger et al.: goede prognose en hebben geen intensificatie van CNS-gerichte therapie nodig. (ALL) Abott et al.: geen prognostisch belang. (AML) Mahmoud et al.: een verhoogd risico op relapse en hebben mogelijks een meer intensieve intrathecale therapie nodig. (ALL) CAVE: Sommige studies (oa Bürger et al. ,Abott et al.) patiënten met blasten in cerebrospinaal vocht met normale cytose, een meer intensieve behandeling kregen dan patiënten zonder blasten in het cerebrospinaal vocht.

Houding kliniek t.o.v. blasten bij lage cytose? Zowel op hematologie als op pediatrische hemato-oncologie wordt er weinig onderscheid gemaakt tussen: Blasten aanwezig in CSV met een cytose onder de 5/µl EN Blasten in CSV met cytose boven de 5/µl.

Lymfomen Belang van detectie van zeer kleine populaties onduidelijk

3. Is flow cytometrie op stalen met een lage cytose of een gering staalvolume zinvol? Besluit Ook bij een gering aantal cellen zullen soms maligniteiten kunnen gediagnosticeerd worden Bij minder dan 10000 cellen zullen sommige analyse resultaten niet meer betrouwbaar kunnen geïnterpreteerd worden Op basis van klinische praktijk in UZ: onvoldoende argumenten om stalen onder een bepaalde cytose te annuleren.

TO DO Indien een staal minder dan 10000 cellen bevat: enkel immunofenotypering uitvoeren indien diagnostisch fenotype van lymfoom/leukemie gekend is. Indien na analyse blijkt dat er minder dan 200 events hebben plaatsgevonden in de diagnostische populatie: “te weinig events aanwezig voor betrouwbare analyse” aan protocol toevoegen Bij toekomstige stalen: nagaan met hoeveel events ‘10000 cellen’ overeenkomt

TO DO Nu: voor B-cell lymphoma: minstens 2 panels van antistoffen, nl: CD45/CD19/kappa lichte keten CD45/CD19/lambda lichte keten Investigeren of we kunnen overschakelen naar 1 panel, nl: CD19/kappa lichte keten/lambda lichte keten (drie-kleuren analyse) CD45/CD19/kappa lichte keten/lambda lichte keten (vier-kleuren analyse)

TO DO Op stalen die ouder zijn dan 24 uur: geen immunofenotypering meer uitvoeren. Stalen die voor 15u00 op het laboratorium toekomen nog dezelfde dag analyseren.

Aanpassen op intranet: TO DO Aanpassen op intranet: Aanpassen afname-instructies: Minimum 2 ml cerebrospinaal vocht opvangen in een steriel buis met schroefdop. Op vrijdag moet staal voor 12 uur op laboratorium toekomen Aanpassen uitvoeringsfrequentie: Geen Immunofenotyp. Diagn & MRD in cerebrospinaalvocht tijdens het week-end.