Laboratorium Bacteriologie Research voor de genotypering van bacteriën Mario Vaneechoutte Laboratorium Bacteriologie Research RAPD of AP-PCR voor de genotypering van bacteriën 19 april 2012 Staf Microbiologie UZ Gent Dia’s beschikbaar op: http://users.ugent.be/~mvaneech/LBR.htm

I. RAPD: Nomenclatuur AP-PCR: arbitrarily primed PCR of? RAPD: randomly amplified polymorphic DNA analysis

II. RAPD: Principe Eén korte primer + Lage annealingst° = veel random priming

Hoe mutaties aanleiding geven tot verschillende RAPD fingerprints II. RAPD: Principe Hoe mutaties aanleiding geven tot verschillende RAPD fingerprints

II. RAPD: Principe Isolaat 1 Isolaat 2 opgezuiverd genomisch DNA PCR met korte primer (5’AGTCAGCCAC) bij lage annealing temperatuur Elektroforese

III. RAPD: Praktisch 1. Start from pure culture 2. Extract DNA for PCR: Crude cell extract 30 min take 1-3 small colonies heat in 100 μl water for 15 min at 95C dilute 1:10 in distilled water centrifuge for 30" use supernatant as DNA-extract 3. PCR-mixture preparation - adding DNA (30 isolates): 30 min PCR ready mix with dNTP, polyme­rase, buffer Add primer at final concentration of 0.1-1 µM Add 1 μl of DNA-target Final volume per reaction: 10 μl 4. PCR-cycling – preparing agarose gel: 2 hours 5. 3% Agarose gel electrophoresis at 7 V/cm 1 hour Total time (1 – 30 isolates) 4 hours

1. Agarose gel electroforese IV. RAPD: PCR + Electroforese 1. Agarose gel electroforese M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 M

2. Capillair electroforese (fluo primer, ABI3130) IV. RAPD: PCR + Electroforese 2. Capillair electroforese (fluo primer, ABI3130)  Hogere resolutie: 1 bp  Automatische digitalisatie A B C C C El Aila et al. 2009. Genotyping of Streptococcus agalactiae (group B streptococci) isolated from vaginal and rectal swabs of women at 35-37 weeks of pregnancy. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 153.

IV. RAPD: PCR + Smelt curve analyse (MCA) 3. McRAPD  Geen electroforese  Automatische analyse  Praktischer – sneller - goedkoper dan electroforese Deschaght et al. 2011. Rapid genotyping of Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolates using melting curve analysis of RAPD-generated DNA-fragments (McRAPD). Res. Microbiol. 162: 386-392.

IV. RAPD: PCR + Smelt curve analyse (MCA) 3. McRAPD  Geen electroforese  Automatische analyse  Praktischer – sneller - goedkoper dan electroforese A A A’ B B C C C C C D D Deschaght et al. 2011. Rapid genotyping of Achromobacter xylosoxidans, Acinetobacter baumannii, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa and Stenotrophomonas maltophilia isolates using melting curve analysis of RAPD-generated DNA-fragments (McRAPD). Res. Microbiol. 162: 386-392.

V. RAPD: reproduceerbaarheid? Typering van Sphingomonas paucimobilis met 2 afzonderlijke random primers: PH1, M13 Andere primers = andere patronen, maar zelfde clustering Andere run met zelfde primer = andere patronen, maar zelfde clustering  RAPD fingerprints zijn reproduceerbaar binnen 1 run: beperkt aantal stammen/test Lemaitre et al. 1996. Tracheal colonization with Sphingomonas paucimobilis in mechanically ventilated neonates due to contaminated ventilator temperature probes. J. Hosp. Infection 32: 199-206.

V. RAPD: Interlaboratorium-reproduceerbaarheid? Set up: 40 clinical Acinetobacter isolates - 7 laboratories DNA-extraction in each lab Ready-to-Go RAPD beads (Pharmacia) Analysis of profiles on agarose gel in each lab Analysis of profiles on high resolution gels on ALF Express (Phar­macia) in one lab Results 1. Highly comparable profiles between labs 2. Clustering reproducibility On agarose gels: identical in 4 labs 3 other labs: 1, 2, 4 isolates wrongly clustered On ALF express: identical for all 7 labs Conclusions 1. High interlaboratory reproducibility of (profiles and) clustering 2. Interpretation and reproducibility problems are due to agarose gel electrophoresis Grundmann et al. 1997. Multicenter study using standardized protocols and reagents for evaluation of reproducibility of PCR-based fingerprinting of Acinetobacter spp. J Clin Microbiol 35: 3071-3077.

V. RAPD: Interlaboratorium-reproduceerbaarheid? Set up: 60 isolaten, 7 laboratoria Resultaten: geen volledige overeenstemming met PFGE 16-30 types naargelang laboratorium toch epidemiologisch correct clusteren (?) Van Belkum et al. 1995. Multicenter evaluation of arbitrarily primed PCR for typing of Staphylococcus aureus strains. J Clin Microbiol 33: 1537-1547.

VI. RAPD: vergelijking met andere genotyperingstechnieken Com­parison of RAPD with other methods for ty­ping of Gram-negati­ves Species Technique compared with Publication A. baumannii Macrorestriction analysis Struelens et al. (1993) A. baumannii SDS PAGE protein profiles Vaneechoutte et al. (1995) E. cloacae Ribotyping Grattard et al. (1994) K. pneumoniae Macrorestriction analysis Gori et al. (1996) P. aeruginosa Serotyping Elaichouni et al. (1994) Phage typing Elaichouni et al. (1994) Results 1. Whatever primer was used: nearly identical clustering with all primers 2. Almost perfect correspondence with other techniques 3. Almost perfect correspondence with epidemiological data Conclusion All DNA-fingerprinting techniques, included RAPD, perform well Certainly for Gram-negatives

VII. RAPD: Toepassingen 1. Opsporen contaminatiebron Nosocomiale outbreaks Bron Pseudomonas aeruginosa besmetting bij muco-patiënten 2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Soort Patiënten Locatie Haemophilus influenzae otitis prone children keel-oor Vaginale soorten zwangere vrouwen rectaal-vaginaal Pseudomonas aeruginosa muco-patiënten sputum eradicatiesucces monitoren voor elke patiënt slechts de verschillende stammen verder typeren (AFLP) 3. Herkennen van virulente stammen Staphylococcus aureus bij konijnen Streptococcus gallolyticus bij duiven

VII. RAPD: Toepassingen Opsporen contaminatiebron. Nosocomiale outbreaks PH1 M13

VII. RAPD: Toepassingen Opsporen contaminatiebron. Nosocomiale outbreaks Lemaitre et al. 1996. Tracheal colonization with Sphingomonas paucimobilis in mechanically ventilated neonates due to contaminated ventilator temperature probes. J. Hosp. Infection 32: 199-206.

VII. RAPD: Toepassingen Opsporen contaminatiebron. Oorsprong P. aeruginosa stam bij nieuw-geïnfecteerde muco-patiënten 50 huizen van nieuw-geïnfecteerden 18 huizen: P. aeruginosa positief (vnl. badkamers) 9 stammen identiek aan stam van de patiënt Besluit: maximum 1 op 5 CF patiënten werd thuis besmet? Schelstraete et al. 2008. Pseudomonas aeruginosa in the home environment of newly infected cystic fibrosis patients. Eur Respir J 31: 822-829.

VII. RAPD: Toepassingen 2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Haemophilus influenzae bij otitis-gevoelige kinderen: vergelijking van keel-oor isolaten Large genetic diversity: all individuals had different strains Except for the 3 sibling pairs: both siblings same strain in throat Paired isolates from nasopharynx and middle ear: 66% of pairs, strain identical After one month interval of sampling: different strains in same patients Easy transmission between individuals and within individuals Rapid turnover = replacement: developing immunity? Dhooge et al. 2000. Turnover of Haemophilus influenzae isolates in otitis-prone children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 54: 7-12.

: keel VII. RAPD: Toepassingen 2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Haemophilus influenzae bij otitis-gevoelige kinderen: vergelijking van keel-oor isolaten : keel : oor (L resp. R) Dhooge et al. 2000. Turnover of Haemophilus influenzae isolates in otitis-prone children. Int J Pediatr Otorhinolaryngol 54: 7-12.

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Vaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 weken

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Vaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 weken GBS NT II III R V A B C C C El Aila et al. 2009. Genotyping of Streptococcus agalactiae (group B streptococci) isolated from vaginal and rectal swabs of women at 35-37 weeks of pregnancy. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 153.

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Vaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 weken Lactobacillus crispatus 50 x zelfde soort V & R 34 x ook zelfde stam El Aila et al. 2009. Identification and genotyping of bacteria from paired vaginal and rectal samples from pregnant women indicates similarity between vaginal and rectal microflora. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 167.

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Vaginale soorten bij zwangere vrouwen: recto-vaginale staalnames 37 weken Enterococcus faecalis R1 R2 R3 R4 V1 V2 El Aila et al. 2009. Identification and genotyping of bacteria from paired vaginal and rectal samples from pregnant women indicates similarity between vaginal and rectal microflora. BMC Infect. Dis. 2009, 9: 167.

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Monitoring van het eradicatiesucces van AB-behandeling bij nieuw-geïnfecteerde muco-patiënten Schelstraete, P., P. Deschaght, L. Van Simaey, S. Van daele, F. Haerynck, M. Vaneechoutte, and F. De Baets. 2010. Genotype based evaluation of Pseudomonas aeruginosa eradication treatment success in cystic fibrosis patients. J Cystic Fibrosis 9: 99–103. Methods: January 2003 - December 2008: respiratory samples cultured from 41 patients with a first ever P. aeruginosa isolate and with early aggressive eradication therapy. Sixteen patients immediately rescued: no further positive cultures Twenty five patients had at least one subsequent isolate: re-infection with other strain or chronic colonization with same strain? Clinical criteria: 3 positive cultures within 6 months  11 chronically colonized < 3 positive cultures within 6 months  14 intermittently colonized Genotypic criteria: 11 chronically colonized: confirmed 7 of 14 ‘intermittently colonized’  are probably also chronically colonized

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Monitoring van het eradicatiesucces van AB-behandeling bij nieuw-geïnfecteerde muco-patiënten Intermittently colonized: < 3 + cultures in last 6 months Patient 17 Patient 18 Same genotype: 50% Patient 19 Patient 20 Patient 21 Patient 22 Patient 23 Patient 24 Patient 25 Patient 26 Patient 27 Patient 28 Patient 29 Patient 30 Chronically colonized: 3 + cultures in last 6 months Patient 31 We also checked the genotypes of the isolated strains and then we saw that for seven out of the 14 patients there was a switch in genotypes while for most of the chronically colonized patients, the same strain persisted. Same genotype: 100% Patient 32 Patient 33 Patient 34 Patient 35 Patient 36 Patient 37 Patient 38 Patient 39 Patient 40 Patient 41 12 months 24 months 36 months 60 months

2. Vergelijken van isolaten van zelfde patiënt Pseudomonas aeruginosa in sputum van gekoloniseerde muco-patiënten Van daele S, M. Vaneechoutte, K. De Boeck, C. Knoop, A. Malfroot, P. Lebecque, J. Leclercq-Foucart, L. Van Schil, K. Desager, and F. De Baets. 2006. Survey of Pseudomonas aeruginosa genotypes in Belgian colonised cystic fibrosis patients. Eur Resp J 28: 740-747. Nationale studie: ‘AFLP’ fingerprinting + digitale electroforese 276 patiënten in 2003 en daarvan 95 nog eens in 2004 AFLP: duur en omslachtig Om werk en kosten te sparen  per patiënt alle isolaten vergelijken met RAPD  per patiënt van elke RAPD genotype slechts 1 stam meenemen in AFLP Conclusies (op basis van RAPD & AFLP): totaal 910 isolaten, 163 genotypes: veel diversiteit in CF populatie 80% van 95 patiënten hebben zelfde stam nog in 2004 75 % van de patiënten hebben slechts 1 stam slechts 10-tal clusters, sommige clusters multicentrisch grootste cluster: 10 patiënten

VII. RAPD: Toepassingen 3. Herkennen virulente stammen: S. aureus bij konijnen Set up: 53 S. aureus stammen uit 13 verschillende kwekerijen 13 RAPD-types Type Stammen Gerelateerd aan chronische stafylococcose a 23 + b 13 - c-m 1 of 2 - NT 1 - Geen type a stammen in kwekerijen zonder chronische infectie Betere overeenstemming met epidemiologie dan faag-biotypering Hermans et al. 2000. Differentation between high and low virulence Staphylococcus aureus strains from rabbits by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD)-analysis. Vet. Microbiol. 72: 311-319. Baele et al. 2000. Genomic fingerprinting of pigeon Streptococcus gallolyticus strains of differing virulence by randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis. Vet. Microbiol. 71: 103-111.

RAPD of AP-PCR voor de genotypering van bacteriën Met dank aan Leen Van Simaey & Bart Saerens Laboratorium Bacteriologie Research RAPD of AP-PCR voor de genotypering van bacteriën 19 april 2012 Staf Microbiologie UZ Gent Dia’s beschikbaar op: http://users.ugent.be/~mvaneech/LBR.htm