keerpunten in de natuurwetenschappen hoe ontdekken we hoe Leven werkt...? roel van driel Swammerdam Inst. voor Levenswetenschappen Universiteit van Amsterdam

is dit iets anders…? leven big bang elementaire deeltjes sterrenstelsels is dit iets anders…? zonnestelsels atomen, moleculen aarde, ecologie leven evolutie keerpunten 5-04 #2

hoe gaan we begrijpen hoe het werkt…? big bang hoe gaan we begrijpen hoe het werkt…? elementaire deeltjes sterrenstelsels zonnestelsels atomen, moleculen aarde, ecologie leven evolutie keerpunten 5-04 #3

de levende cel keerpunten 5-04 #4

de levende cel keerpunten 5-04 #5

de levende cel keerpunten 5-04 #6

genetische informatie: de basis DNA een gen bevat de informatie voor de aminozuur-volgorde van een eiwit aminozuurvolgorde bepaalt de opvouwing van het eiwit opvouwing van het eiwit bepaalt de functie dus: een gen codeert voor een functie in de cel eiwit functie in de cel keerpunten 5-04 #7

de DNA taal genetische code is simpele taal met slechts vier letters A, T, G, C keerpunten 5-04 #8

eiwitten kunnen bijna alles elk gen bevat de informatie voor één bepaald eiwit keerpunten 5-04 #9

wat maakt eiwitten zo bijzonder elk eiwit is lange onvertakte keten van aminozuren 20 verschillende aminozuren heel breed scala van functies specificiteit heel precies herkennen, binden en chemisch veranderen van andere moleculen keerpunten 5-04 #10

eiwitten en genen werken samen in netwerken netwerken van samenwerkende componenten in de cel eiwitten en enzymen genen speciale systeem- eigenschappen geselecteerd tijdens evolutie robuustheid efficientie aanpassen aan omgeving ‘leven’ is een netwerk van chemische en fysische netwerken keerpunten 5-04 #11

eiwitten en genen: samenspel is alles...! DNA genen in DNA coderen voor eiwitten eiwitten bepalen de eigenschappen van de cel eiwitten zetten genen aan en uit die genen coderen weer voor weer voor eiwitten die eiwitten geven weer nieuwe eigenschappen aan een cel eiwit functie in de cel keerpunten 5-04 #12

de wondere wereld van het biologisch onderzoek menu van vandaag kijken naar moleculen in de levende cel gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen keerpunten 5-04 #13

zichtbaar maken van eiwitten in de levende cel met de hulp van een kwal... green fluorescent protein (GFP) - GFP is een eiwit met ~225 aminozuren van de kwal Aequorea victoria - gen dat codeert voor GFP is gecloneerd keerpunten 5-04 #14

GFP fusie-eiwitten extreem handig koppel eiwit waarin je geinteresseerd bent aan GFP eiwit je eiwit wordt dan lichtgevend danzichtbaar in microscoop keerpunten 5-04 #15

+ GFP-fusie eiwit uitvoerbaar voor elk eiwit gen voor GFP eiwit gen voor histon eiwit gen voor GFP-histon fusie eiwit + uitvoerbaar voor elk eiwit keerpunten 5-04 #16

bijvoorbeeld: zichtbaar maken van het menselijk genoom in de levende cel DNA verpakkings-eiwit koppelen aan GFP GFP-histon H2B gen dat codeert voor dit eiwit in cel brengen cel maakt het juiste GFP-gekoppelde eiwit keerpunten 5-04 #17

GFP is een fluorescerend eiwit: zichtbaar maken in een fluorescentie-microscoop preparaat bestralen in microscoop met blauw licht GFP absorbeert blauw licht GFP zendt groen licht uit keerpunten 5-04 #18

fluorescentie microscopie voor 3-dimensionale beelden microscoop keerpunten 5-04 #19

menselijk genoom in levende cel zichtbaar gemaakt keerpunten 5-04 #20

een andere toepassing van GFP fusie eiwitten hoe overleef ik mijn zonnebank, of een dagje aan het strand…? keerpunten 5-04 #21

zonlicht bevat UV DNA schade na een uurtje in de zon of op de zonnebank door UV licht vele duizenden DNA beschadigingen in elke huidcel...! toch maar kleine kans op bijv. kanker we hebben heel efficiënte systemen om DNA schade te repareren keerpunten 5-04 #22

cyclobutane pyrimidine dimer stukje onbeschadigd DNA ultraviolet licht induceert chemische reacties in DNA UV licht cyclobutane pyrimidine dimer DNA beschadiging geeft mutaties stukje onbeschadigd DNA keerpunten 5-04 #23 pyrimidine (6-4) pyrimidone photoproduct

X X X mutaties mutatie is verandering van nucleotiden-volgorde in DNA resulteert in andere aminozuurvolgorde van eiwit waarvoor gen codeert meestal verlies van functie van eiwit meestal verlies van eigenschap van cel mutaties kunnen ziekten veroorzaken bijvoorbeeld kanker X X X keerpunten 5-04 #24

DNA reparatie systeem verschillende DNA reparatie-eiwitten binden aan beschadigd DNA samen repareren ze de DNA schade onderzoek hoe dit werkt in de levende cel laat cel GFP-repair fusie-eiwitten maken keerpunten 5-04 #25

onderzoek naar hoe DNA reparatie werkt maak één van de reparatie eiwitten fluorescent mbv GFP zichtbaar mbv microscoop in celkern celkern lokaal bestralen met UV licht in rode cirkel lichtgevende reparatie-eiwit bindt aan het beschadigde DNA hopen zich op in beschadigd gebied keerpunten 5-04 #26

een zonnebank voor cellen in een microscoop masker met kleine gaatjes (1/200 mm) glaasje met levende cellen keerpunten 5-04 #27 cel met lokale DNA schade

masker met heel kleine gaatjes in de microscoop gaatjes van 5 micrometer (1/200 millimeter) keerpunten 5-04 #28

masker bovenop laagje levende cellen keerpunten 5-04 #29

filter bovenop laagje levende cellen fluorescerende GFP-reparatie eiwit in cel masker keerpunten 5-04 #30

precies meten hoe het reparatie- eiwit aan beschadigd DNA bindt keerpunten 5-04 #31

zelfde metingen voor verschillende reparatie eiwitten XPB-EGFP accumulation at UV damage -5 5 10 15 20 25 200 400 600 800 1000 1200 Time (sec) % accumulation in spot 37 C 27 C keerpunten 5-04 #32

resultaten samenbrengen in een computermodel computer modellen experimenten keerpunten 5-04 #33

de wondere wereld van het biologisch onderzoek menu van vandaag kijken naar moleculen in de levende cel gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen keerpunten 5-04 #34

gentherapie made simpel DNA gen  eiwit  functie mutatie  defect gen  defect eiwit  verlies functie concept van gentherapie is simpel DNA in cel brengen met goed-functionerend gen defect gerepareerd...! eiwit functie in de cel keerpunten 5-04 #35

boodschappenlijst gentherapie gen vinden bij specifieke ziekte kloneren van dat gen geschikte vector om gen in de cel te brengen target cellen identificeren target cellen bereiken met vector ingebrachte gen stabiel in cel integreren ingebrachte gen stabiel tot expressie brengen keerpunten 5-04 #36

problemen en denkbare oplossingen…? hoe breng je het gen in de juiste cel…? selectief of alle cellen die bereikt worden...? genetisch veranderen buiten het lichaam...? haal te veranderen cellen uit het lichaam en breng nieuw gen in plaats de veranderde cellen terug in lichaam gebruik van stamcellen...? genetisch veranderen en dan terugplaatsen in lichaam bijv. stamcellen in beenmerg voor alle bloedcellen keerpunten 5-04 #37

waar richt gentherapie zich op clinical trials kanker-therapie is favoriet keerpunten 5-04 #38

het succesverhaal van SCID ADA gentherapie defect gen voor enzym adenosine deaminase (ADA) severe combined immune deficiency (SCID) syndroom eerste klinische testen in 1990 ander SCID syndroom (SCID-X1) succesvolle gentherapie sinds 2000 17 van 18 SCID patiënten na gentherapie goede expressie van ingebracht gen zeer succesvol maar...! keerpunten 5-04 #39

gentherapie voor SCID bloed-stamcellen isoleren uit beenmerg buiten het lichaam het gen inbrengen overgebleven beenmergcellen in lichaam doden genetisch veranderde cellen in bloedbaan nestelen zich in beenmerg produceren genetisch veranderde bloedcellen keerpunten 5-04 #40

wat genetisch mis kan gaan bij gentherapie 2002: gentherapie veroorzaakt leukemie in twee patiënten SCID-X1 gentherapie bij 3 jonge kinderen na 3 jaar krijgen 2 kinderen leukemie door toeval(??) insertie van ingebrachte gen in een oncogen totale verrassing FDA verbiedt SCID-X1 gentherapie tenzij er geen enkele andere optie is moeilijke keuzes, etisch probleem X X keerpunten 5-04 #41

problemen en oplossingen…? meeste virussen integreren hun DNA in genrijke gebieden in genoom risico...! sturen van transgen in DNA maar hoe...? denkbaar alternatief ingebrachte gen niet laten integreren in DNA van cel DNA van sommige virussen blijft als los stukje DNA in de celkern (episoom) repliceert gelijktijdig met cel DNA tijdens celdeling ? X X keerpunten 5-04 #42

hoe wordt het DNA in de cel gebracht...? meestal m.b.v. virus keerpunten 5-04 #43

virussen vaak gebruikt om DNA binnen te brengen bij gentherapie keerpunten 5-04 #44 Thomas et al., 2003

gentherapie met adenovirus is efficient maar sterke afweerreacties veel succesvol genetisch veranderde cellen in lever m.b.v. adenovirus heel veel cellen van afweersysteem infiltreren lever leverweefsel keerpunten 5-04 #45

wat immunologisch mis kan gaan bij gentherapie 1999: adenovirus vector veroorzaakt dood van patiënt vrijwilliger Jesse Gelsinger, 18 jaar, Philadelphia leed aan milde vorm ornithine decarboxylase deficientie productie van giftig NH3 hyper immuunreactie op ingespoten adenovirus (zeldzaam...!!) na 4 dagen overleden injectie van grote hoeveelheid (inactieve) virusdeeltjes nu onveilig geacht door FDA keerpunten 5-04 #46

toekomst van gentherapie 2004 onderzoek gaat onvermoeibaar verder...! keerpunten 5-04 #47

de wondere wereld van het biologisch onderzoek menu van vandaag kijken naar moleculen in de levende cel gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen keerpunten 5-04 #48

een droom-experiment in één enkel experiment bij een cel vaststellen welke genen wel en welke genen niet aan staan mens: 35.000 genen het is mogelijk...! DNA micro-arrays DNA chips keerpunten 5-04 #49

hoe meet je de activiteit van een gen...? RNA van gen 1 RNA van gen 2 gen 3 alleen genen die aan staan produceren RNA hoe meer RNA hoe groter de aktiviteit van een gen keerpunten 5-04 #50

genexpressie meten aan de hand van RNA concentratie in de cel celtype 1 celtype 2 vier mogelijkheden genen even actief in beide celtypen genen aktiever in één van de celtypes genen actief in slechts één celtype genen inactief in beide celtypen keerpunten 5-04 #51

componenten van de DNA microarray technologie 1 2 3 4 5 6 A B C D E F duizenden spotjes op aan glaasje elk spotje heeft stukjes DNA van een specifiek gen 35.000 spotjes genoeg voor alle menselijke genen in principe... keerpunten 5-04 #52

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * isoleer RNA en maak het fluorescerend GROEN isoleer RNA en maak het fluorescerend ROOD 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #53

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #54

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #55

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #56

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F * keerpunten 5-04 #57

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * specifieke binding van alleen de juiste nucleotiden volgorde via dubbelstrengs DNA: A-T en G-C...! 1 2 3 4 5 6 A B C D E F * keerpunten 5-04 #58

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F alleen RNA van referentie cellen: dus spot is GROEN keerpunten 5-04 #59

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #60

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #61

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #62

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F alleen RNA van te analyseren cellen: dus spot is ROOD keerpunten 5-04 #63

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #64

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #65

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #66

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * * * 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #67

microarray technologie referentie cellen te analyseren cellen * * * RNA van referentie cellen en van te analyseren cellen: GROEN plus ROOD is GEEL 1 2 3 4 5 6 A B C D E F keerpunten 5-04 #68

verband genexpressie en fluorescentiesignaal 1 2 3 4 5 6 celtype 1 celtype 2 Genexpressie gen 1F - ++++ gen 3E gen 5C gen 5B ++ keerpunten 5-04 #69

microarray met DNA spots van 7.500 genen van de muis keerpunten 5-04 #70

microarray met DNA spots van 7.500 genen van de muis keerpunten 5-04 #71

DNA microarray om genen te vinden in relatie tot een ziekte isolatie en labelling gezond microarray ziek isolatie en labelling binden aan microarray spotjes meten data extractie + analyse identificatie van genen met andere activiteit bij ziekte keerpunten 5-04 #72

voorbeerd toepassing microarray voor diagnostiek van borstkanker door NKI traditionele diagnostiek ~30% patiënten overlijdt aan borstkanker binnen 10 jaar ~70% overleeft 10 jaar of meer overlevenden iedereen krijgt chemotherapie...! tijd (jaren) keerpunten 5-04 #73

identificatie van genen waarvan de activiteit verandert bij borstkanker tijd (jaren) overlevenden analyse van 78 humane borsttumoren 34 metastase-positief binnen 5 jaar slechte prognose 44 metastase-negatief gedurende 5 jaar goede prognose keerpunten 5-04 #74

analyse borstkanker microarrays 78 borsttumoren geanalyseerd 34 ‘slecht’ vergeleken met 44 ‘goed’ microarray met 24.000 genen 5.000 genen vertoonde veranderde expressie in tumoren verschillende klassen borsttumoren...! keerpunten 5-04 #75

70 genen geïdentificeerd die verloop van het ziekte goed kunnen voorspellen metastases 70 geselecteerde genen rangorde (wit = +) goede prognose 78 tumoren slechte prognose keerpunten 5-04 #76

microarray classificatie vs. NIH classificatie klassieke NIH classificatie 59% 74% 5 % laag risico 95 % hoog risico 96% 50% classificatie op basis van microarray 39 % laag risico 61 % hoog profiel classificatie van 158 borstkanker-tumoren minder onnodige chemo-therapie identificatie van genen die een rol spelen bij borstkanker keerpunten 5-04 #77

de wondere wereld van het biologisch onderzoek menu van vandaag kijken naar moleculen in de levende cel gentherapie DNA chip technologie PCR en toepassingen keerpunten 5-04 #78

PCR: een brilliant idee polymerase chain reaction PCR brain wave van Kary Willis nobelprijs 1997 uit een heel klein beetje DNA veel DNA maken precieze kopie extreem belangrijk in onderzoek bijv. microarray analyse bijv. forensisch onderzoek Kary Mullis nobelprijs 1997 keerpunten 5-04 #79

PCR: een simpele truc het DNA tussen de primers wordt geamplificeerd amplificeren van een specifiek deel van het DNA maak twee korte stukjes DNA met zelfde nucleotiden-volgorde als aan beide kanten van te amplificeren stuk DNA twee primers het DNA tussen de primers wordt geamplificeerd techniek om stukken DNA te scheiden op basis van verschil in grootte keerpunten 5-04 #80

PCR: een simpele truc het DNA tussen de primers wordt geamplificeerd amplificeren van een specifiek deel van het DNA maak twee korte stukjes DNA met zelfde nucleotiden-volgorde als aan beide kanten van te amplificeren stuk DNA twee primers het DNA tussen de primers wordt geamplificeerd techniek om stukken DNA te scheiden op basis van verschil in grootte keerpunten 5-04 #81

PCR is efficiente methode om DNA van verschillende individuen te onderscheiden DNA van verschillende personen verschilt op veel plaatsen in genoom ook vaak verschil tussen beide homologe chromosomen in een individu verschillen worden doorgegeven aan nakomelingen keerpunten 5-04 #82

over PCR PCR cartoon PCR in juridisch onderzoek keerpunten 5-04 #83

hoe gaan we begrijpen hoe het werkt…? big bang hoe gaan we begrijpen hoe het werkt…? elementaire deeltjes sterrenstelsels zonnestelsels atomen, moleculen aarde, ecologie leven evolutie keerpunten 5-04 #84

ja en nee is dit iets anders…? leven big bang elementaire deeltjes sterrenstelsels zelfde natuurwetten, maar speciale soorten moleculen, die samenwerken in netwerken is dit iets anders…? zonnestelsels atomen, moleculen aarde, ecologie leven evolutie keerpunten 5-04 #85