CD134L expressie op dendritische cellen in MLN veroorzaakt colitis in T-cel herstelde SCID-muizen Boulanger Katrien Luyts Katrien

Localisatie mesenterische lymfe knoop (MLN)

•Aantal T-cellen in periferie onder strikte controle: * immuun-competent  weinig toename, stabiel niveau * immuun-defici ̈ ent  enorme expansie (x 10000) in darmen •Transfer van CD45RB high CD4 + T cellen naar SCID muizen  colitis ontwikkeling •Transfer van CD45RB high CD4 + T cellen naar kiemvrij gekweekte SCID muizen  T-cel expantie gereduceerd  belang van endogene microbiële flora

CD4+ Geactiveerde DC CD134L CD134 COLITIS Anti-CD 134L mAb = OX89

Testopzet •Modelsysteem: transfer van CD45RB high CD4 + T cellen naar 8 weken oude SCID muizen  Th1- gemedieerde colitis (IBD) •15-36 x meer CD134L + geactiveerde DC cellen in MLN bij colitis •Voorkomen door anti-CD134L mAb cotransfer met CD45RB low T reg cellen

Het experiment 4 stappen: •Productie en moleculaire karakterisatie van een anti- CD134L mAb •OX89 behandeling voorkomt colitis •OX89 behandeling voorkomt T-cel expansie en homing •Colitis wordt gekenmerkt door een stijging van het aantal DC cellen in MLN die CD134L tot expressie brengen

1. Productie en moleculaire karakterisatie van een anti- CD134L mAb = OX89 •OX89  fusie van NS1 myelomacellen en miltcellen van rat geïmmuniseerd met CD4 CD134L (Freund’s complete en incomplete adjuvant) •Collectie splenocyten 4d na laatste immunisatie •Screening hybridoma voor mogenlijkheid voor binding aan het recombinant prote ̈ ine, geactiveerde T-cellen en cellen getransfecteerd met recombinant muizen CD134L •Voor in vivo onderzoek: OX89 en rat anti-muizen IgG1 isotype controle opzuiveren door affeniteitschromatografie.

OX89 bindt specifiek aan CD134L- getransfereerde fibroblastcellen.

OX89 kan de CD134-CD134L interactie blokkeren

•Doel: effecten van OX89 op Tcel- gemedieerde immuunpathologie nagaan. •Model: C.B.-17 SCID muizen hersteld met CD45RB high CD4 + T cellen en behandeld met OX89 of isotypische controle mAb. 2. OX89 behandeling voorkomt colitis

OX89 behandeling voorkomt colitis

Morfologische veranderingen bij colitis. CONTROLE

Totaal aantal CD4+T cellen gecorreleerd met ziekte. COLITIS ONTWIKKELING GEEN COLITISONTWIKKELING

3.OX89 behandeling voorkomt T-cel expansie en homing OX89 kan ingrijpen op verschillende niveau’s: 1.Inhibitie van de homing van de T-cellen naar de darmen. 2.Inhibitie van de perifere T-cel herstel in de milt of MLN.  verder onderzoek door analyse van het aantal T-cellen in de verschillende organen.

Mogelijke werkingsmechanismen OX89  Mechanisme ongekend  3 mogelijke werkingsmechanismen: 1. Interactie tussen CD134 en CD134L blokkeren  geen signaaltransductie 2. OX89mAb  down-regulatie CD134L 3. Signalen geven aan DC

Aantal T-cellen in de milt

Aantal T-cellen in MLN.

T-cel retentie in MLN.

α4β7 integrine op CD4 + T-cellen

Aantal T-cellen in lamina propria

4.Colitis wordt gekenmerkt door een stijging van het aantal DC cellen in MLN die CD134L tot expressie brengen Doel: om te onderzoeken waar de interactie tussen CD134 en CD134L optreedt.

CONTROLE CD11 en CD134L expressie in MLN

CONTROLE CD11 en CD134L expressie in colon secties

Cytofluorografie van MLN

Aantal CD134 + CD4 + cellen in MLN

Uit de 2 vorige experimenten kan besloten worden dat: 1.Interactie tussen CD134 en CD134L waarschijnlijk zal optreden in de MLN eerder dan in het colon van T-cel herstelde muizen. 2.Door OX89 behandeling wordt de T-cel activatie in de MLN verhinderd en treedt er geen colitis op  T-cel interactie met CD134L + DC in MLN is cruciaal voor pathogenese.

Model van ontsteking in de darm veroorzaakt door intestinale bacteriën •Intestinale bacteriën  verhoogde recrutering DC, accumulatie •DC worden geactiveerd en migreren naar MLN •In MLN : activatie van T-cellen: *Geen Treg aanwezig:  ongecontroleerde T-cel expansie *In aanwezigheid IL-12  Th1 •T-cel homing naar darmen •Secundaire stimulatie  effector functie  verhoogde graad van inflammatie •Dit zorgt voor bijkomende DC recrutering naar LP  COLITIS

Besluiten 1.Geactiveerde DC zijn aanwezig in significant verminderde aantallen in SCID muizen in vergelijking met SCID muizen hersteld met CD45RB high CD4 + cellen.  Leveren mogelijk initieel costimulatorisch signaal geven dat zorgt voor de differentiatie van CD45RB high tot pathogene Th1 cellen 2.Muizen worden beschermd voor colitis door transfer van Treg cellen. Deze muizen hebben dezelfde aantallen van CD134L+ DC als onherstelde muizen  Inhibitie van accumulatie van geactiveerde CD134L+DC in MLN is kenmerk van de immuun-suppressieve eigenschappen van Treg.