Sla dit PowerPoint bestand nu eerst onder je groepsnaam op (rechtsklik>End Show, dan: File>Save As) Opdracht 1 Om DNA te knippen en te kunnen bekijken in een agarose-gel, knipt men veelal een paar honderd nanogram DNA met een paar units restrictie-enzym in 10 tot 25 microliter van een (voor het enzym optimale) bufferoplossing. Onderstaande zes pipetteerschema’s zijn bedoeld voor de volgende knipreactie: 0,5 microgram DNA moet worden geknipt met 5u EcoR I in een volume van 20 microliter (EcoR I heeft Buffer 1 nodig voor optimale werking). De hieronder afgebeelde schema’s 1 t/m 6 zijn niet allemaal correct.. Welke van de schema’s is/zijn wél goed voor het inzetten van deze reactie? (zie ook Info over de gebruikte eenheden) Vul je antwoord in op je antwoordformulier.
Hulp bij Opdracht 1 Hoe zat het ook alweer met die eenheden en afkortingen? Terug naar Opdracht1? Klik hier.
Opdracht 2 (z) (x) (x) (y) Zie hieronder een onvolledig kaartje (links) van een fictief plasmide en een nep-gelfoto (rechts) met het bandjespatroon van digesties daarvan. Bekijk de twee onderstaande afbeeldingen, probeer ze te begrijpen en vind uit, welke van de herkenningsplaatsen I t/m IV in het kaartje geknipt kunnen worden door welke van de restrictie-enzymen x, y en z. Op welke van de posities 01 t/m 08 in de gel bevinden zich fragmenten a,b,c en d (of combinaties daarvan). Invullen in op je antwoordformulier. (z) (x) (x) (y)
Over pBRl15 pBRl15 DNA, het recombinante plasmide dat gecontroleerd moet worden, is opgestuurd door een bevriende onderzoeker. Het is een recombinant plasmide: een klein, circulair DNA uit een bacterie, met een stukje DNA van een ander organisme, in dit geval een bacterie-virus (een bacteriofaag Lambda) , erin. De collega meldt ons: “het kleine EcoRI - BamHI fragment in pBR322 is vervangen door het EcoRI (positie 26104) - BamHI (positie 27972) - fragment uit Lambda” en vermeldt ook nog, dat hij niet helemáal zeker weet of het opgestuurde DNA inderdaad het juiste is. Wij zijn daar mooi klaar mee.. We moeten dus controleren of de DNA-oplossing, die we gekregen hebben inderdaad pBRl15 DNA bevat. Dat doen we door dit DNA te knippen met de drie restrictie-enzymen, die we tot onze beschikking hebben: BamH I, EcoR I en Pst I. Van zowel het plasmide pBR322 als de bacteriofaag Lambda is de hele basenvolgorde bekend, en dus ook alle restrictie-enzym-herkenningsplaatsen, die erin voorkomen. Reken uit, nu je weet hoe pBR15 in elkaar gezet is, en m.b.v. de informatie op de volgende dia’s, - hoe groot het pBR15 plasmide is, - wáar de EcoR I, de BamH I en de Pst I herkenningsplekken in dat plasmide zitten, en hoevér van elkaar. Deze informatie bij elkaar vormt een restrictie-kaart van het plasmide, en kan als een plaatje weergegeven worden.
Nog even ter herinnering: over pBRl15 was het volgende vermeld: Info over pBR322 Nog even ter herinnering: over pBRl15 was het volgende vermeld: “het kleine EcoRI - BamHI fragment in pBR322 is vervangen door het EcoRI (positie 26104) - BamHI (positie 27972) - fragment uit Lambda” Restrictiekaartje van pBR322 met de posities van de BamH I, EcoR I en Pst I herkenningsplaatsen:
Info over Lambda DNA Nog even ter herinnering: over pBRl15 was het volgende vermeld: “het kleine EcoRI - BamHI fragment in pBR322 is vervangen door het EcoRI (positie 26104) - BamHI (positie 27972) fragment uit Lambda” Bacteriophage Lambda DNA omvat 48502 baseparen, en is lineair. Het bevat de volgende BamH I, EcoR I en Pst I herkenningsplaatsen: 5 BamH I knipplaatsen: op posities 5505 22346 27972 34499 41732 5 EcoR I knipplaatsen: op posities 21226 26104 31747 39168 44972 28 Pst I knipplaatsen: op posities 2560 2824 3629 3644 3860 4374 4713 4913 5124 5218 5686 8524 9617 9781 11767 11839 14298 14385 16085 16235 17394 19837 20285 22425 26932 32009 32256 37005
Opdracht 3 Vul II t/m IV in: I = Pst I herkenningsplaats (hp) Gebruik de info van de vorige dia’s om zelf een schetsje te tekenen van pBRl15. Doe aan de hand van je schetsje het volgende: Reken uit en vul verder in (op je antwoordenformulier) : wáar zitten wélke knipplaatsen, als we plek I (zie hieronder) een Pst I plaats laten zijn. Vul II t/m IV in: I = Pst I herkenningsplaats (hp) II = EcoR l hp III = Pst l hp IV = Bam H l hp Vul lengtes (aantal baseparen) in a = 3332 b = 654 c = 827 of 1041 d = 1041 of 827
Opdracht 4 Welk bandenpatroon verwacht je van je digesties, die je op dit moment in hebt staan? “Teken” de DNA-bandjes in de gel hiernaast: Ga over naar EditView (rechtsklik>End Show). Gebruik onderstaand witte rechthoekje (uit Autoshapes>BasicShapes>Rectangle) om “bandjes” te maken in de gelfoto (laan 8 is al ingevuld; zie voor de groottes van de markerfragmenten je infoblaadje). Ctrl-sleep het blokje om een nieuw bandje te maken; Shift-sleep om gemakkelijk precies horizontaal of verticaal te slepen.. Vergeet niet tussendoor je wijzigingen op te slaan! Vergeet niet, na het maken van de “bandjes”, deze presentatie op te slaan, en ga dan de ingevulde gel foto van hiernaast vergelijken met die van een paar andere groepjes, en zorg ervoor dat jullie het eens worden over de correcte voorspelling …. Ga dan een foto maken van je échte gel en vergelijk die met de voorspelling!
Je pBRl15 digestie Voor als je je infoblaadje niet bij de hand hebt: Even ter herinnering: als het goed is, heb je je gel “geladen” met de volgende knipreactiemengsels: (B = BamH I, E = EcoR I, P = Pst I) ( x = geknipt met) pBRl15 x B pBRl15 x E pBRl15 x P pBRl15 x BE (= geknipt met BamH I én tegelijk met EcoR I pBRl15 x BP pBRl15 x EP pBRl15 x BEP Een mengsel DNA fragmenten van bekende grootte en hoeveelheid (is al afgebeeld op de in te vullen gel..) Terug naar opdracht 4
Tijd over? Als je tijd over hebt, kun je hieronder een restrictiekaartje van pBR15 tekenen, zoals in dia Opdracht 3, maar deze keer op de juiste schaal… (zorg, dat je via View>Toolbars>Drawing onderaan je scherm de attributen om te kunnen tekenen beschikbaar hebt)