I MMUNOHISTOCHEMISCHE DETECTIE VAN LMP 1 IN LYMFOPROLIFERATIEVE AANDOENINGEN Dienst Pathologische anatomie UZ Gent Begeleiders: Laura Vermeulen Prof. Dr. Louis Libbrecht NIELS VELGHE

INHOUD Doelstelling Inleiding Epstein-barr virus Wat is LMP1? EBV-geassocieerde aandoeningen Materiaal en methoden Resultaten Besluit 2

D OELSTELLING Op punt stellen van een immunohistochemische kleuring Aanwezigheid Epstein-Barr virus geïnfecteerde cellen aantonen Vergelijken met de resultaten van de chromogeen in situ hybridisatie (CISH) 3

E PSTEIN -B ARR - VIRUS (EBV) Gammaretrovirus (HHV-4)  herpesvirus Torus-vormig kerneiwit Lineair dubbelstrengig 172Kb  codeert > 85 genen Latent aanwezig = 3 types 4

L ATENTIETYPES LYMFOPROLIFERATIEVE AANDOENINGEN Latentie Type 1 Burkitt Type 2 Hodgkin Type 3 PTLD 5

LMP 1 Latent membraan proteïne 1 Integraal membraan eiwit van het EBV Oncogeen eiwit Induceert expressie van verschillende merkers In B-lymfo’s  cellulaire genen(Bcl2, IL-10) reguleren Transformerende effecten + expressie in HRS  belangrijk in Hodgkin diagnose Infectieuze mononucleosis 6

EBV - GEASSOCIEERDE AANDOENINGEN EBV Hodgkin Non- Hodgkin Carcinomen Benigne reactieve infecties 7

M ATERIAAL Benchmark XT (ventana –Roche) Tissue Teck (Sakura) Gebruikte toestellen

M ATERIAAL Reagentia EZ prep concentraat (10x) LCS (Liquid coverslip) 2 x SSC (Sodium Chloride Sodium citraat) Reactiebuffer (10X) CC1 (Cell Conditioning solution 1)  EDTA CC2 (Cell Conditioning solution 2)  Citraat 9

M ATERIAAL Reagentia carrousel Hematoxyline I en II (tegenkleuring) Bluing reagens ( tegenkleuring 2) Protease I Amplificatiekit Ultraview Universal DAB detection Kit Uv DAB inhibitor Uv HRP multimeer Uv DAB chromogeen Uv DAB H 2 O 2 Uv copper 10

M ATERIAAL Primair antilichaam Cocktail (Clones CS1-4) Dako Monoclonale muis ‘anti-EBV’ LMP1 antilichamen Wordt verdund met Antibody diluent  manuele stap 11

M ETHODEN Chromogeen In Situ Hybridisatie Pathways Immunohistochemisch LMP1 detectie in cytoplasma en in oppervlaktemembraan EBER detectie gelokaliseerd in de kern (blauwe kern) Methode op punt stellenTer controle EBV positief CISH LMP1 12

P RINCIPE VAN DE MULTIMEER DETECTIE 13

O P PUNT STELLEN VAN METHODE Immunohistochemische kleuring Hitte geïnduceerd voorbehandeling Cel conditioner 1 EDTA-buffer (Ph>7) Cel conditioner 2 Citraatbuffer (Ph<7) Enzymatische voorbehandeling Protease 1 14

M ETHODEN / O VERZICHT

Cel conditioner 1 EDTA-buffer R ESULTAAT 16

BETROUWBAARHEID Hodgkindiagnose = EBER + en LMP 1 + (in HRS cellen) Bij zwak signaal  ↑ kans op foute interpretatie Betrouwbare diagnose LMP1CISHMorfologie 17

O ORZAKEN VAN VALSE RESULTATEN Degradatie van het RNA ‘Hit en Run’ hypothese Interferentie Zwakke expressie van LMP1 Slechtere kwaliteit van het weefsel Slechte fixatie van het weefsel 18

B ESLUIT De basisvaardigheden zijn verworven Mogelijk om IHC-kleuring te optimaliseren  detecteren van LMP1 Voorbehandelingstappen van groot belang  ↑↑↑ invloed op kleuring Hoe ↑ de kennis van mogelijke problemen  hoe ↑ de interpretatie van het beeld. 19

I MMUNOHISTOCHEMISCHE DETECTIE VAN LMP 1 IN LYMFOPROLIFERATIEVE AANDOENINGEN Dienst Pathologische anatomie UZ Gent Begeleiders: Laura Vermeulen Prof. Dr. Louis Libbrecht NIELS VELGHE