De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

De presentatie wordt gedownload. Even geduld aub

PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof.

Verwante presentaties


Presentatie over: "PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof."— Transcript van de presentatie:

1 PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof op een bepaald ogenblik Tweedimensionele electroforese (Tweedimensionele chromatografie) Massaspectrometrie Technieken

2 2-D gel electrophoresis (1) charge (2) size Protein mixture Protein separation according to :

3 HART “mastergel” German Heart Institute Berlin (2002)

4 Controle Rat serum Acute ontsteking (turpentine) E. Gianazza (2002)

5 ionen bron massa analyzer detector vacuüm Massaspectrometer Iontrap Electrospray (ESI)

6

7 iontrap

8 ionenbron iontrap + helium 1- 4 kV electrospray

9

10

11

12

13 m z

14 Onze strategie Scheiding van eiwitmengsel dmv 2DE  gelspot  optimaal slechts 1 eiwit  eiwit in gel  trypsine-behandeling  specifieke knipplaatsen [het maximaal aantal eiwitstukjes (= peptiden) is voorspelbaar] [hoe groter het eiwit, des te meer peptiden ]  complex mengsel  Verdere scheiding van peptidenmengsel dmv chromatografie trypsine peptiden A B C D E F G eiwit Chromatografie A E B F G C massa- spectrometer peptiden- mengsel Stroomrichting over chromatografiekolom ruwe data

15 intensiteit m/z massaspectrum van de kolomuitstroom is weliswaar minder complex maar blijft toch nog te complex voor de massaspectrometer: Kan wel alle ionen die op een bepaald ogenblik uit de kolom stromen “wegen”, maar kan er geen verdere “sequentieinformatie” uithalen, behalve uit de drie meest intense ionen (instrumentele beperking  er gaat mogelijks veel informatie verloren) Sequentieinformatie wordt bekomen dmv fragmentatie van het peptide C ion  het bekomen massaspectrum noemt men een fragmentatiespectrum Per full scan spectrum krijgen we maximaal 3 fragmentatiespectra (volledige cycle time: ca 1.5 sec) Fictief massaspectrum op ogenblik dat peptide C uit de kolom stroomt “gewicht” van peptide C (full scan spectrum)

16 Peptide sequentiebepaling met MS/MS NH 2 COOH C-R-I-S-T-A C-R-I-S-T-A-L C-R-I-S C-R-I C-R-I-S-T C-R C S-T-A-L I-S-T-A-L T-A-L A-L R-I-S-T-A-L C-R-I-S-T-A-L L b-ioneny-ionen m/z MS/MS

17 Sequentie-ionen P. Roepstorff & J. Fohlman, Biomed. Mass Spectrom. 11, 601 (1984)

18 chromatogram een parent-ion (één van de vele) m/z = z = 2+ (806.8 * 2)-2= Da massa neutraal peptide

19 Parent m/z = MS/MS spectrum y3 y4 y5 y6 y7 y8 y9 y10 y11 y12

20 m/z  m/z sequentie D NWDSVTST Asp Asn Trp Asp Ser Val Thr Ser Thr RHFWQQDEPP QSPWDRVKDL ATVYVDVLKD SGRDYVSQFE GSALGKQLNL KLLDNWDSVT STFSKLREQL GPVTQEFWDN LEKETEGLRQ EMSKDLEEVK AKVQPYLDDF QKKWQEEMEL YRQKVEPLRA ELQEGARQKL HELQEKLSPL GEEMRDRARA HVDALRTHLA PYSDELRQRL AARLEALKEN GGARLAEYHA KATEHLSTLS EKAKPALEDL RQGLLPVLES FKVSFLSALE EYTKKLNTQ Apolipoproteïne A1

21 b) Dataverwerking 1 ruwe datafile per analyse (per gel spot) a) Data-acquisitie (software: Xcalibur versie 3.1) Raw datafile-format (bestaande uit full scan spectra en fragmentaitiespectra) dta-file format (alleen fragmentatiespectra) Mascot Sequest Rapport 1 Rapport 2 (. dat file) (.out file) search

22 Van ruwe data tot identificatie van eiwit

23

24

25

26 Welke ruwe datafile moet er verwerkt worden ?

27 Ruwe datafile (verzameling van full scan spectra en fragmentatiespectra) omvormen naar een set bestaande uit enkel fragmentatiefiles = dta-format ( 1 fragmentatiespectrum = 1 dta.file)

28

29

30 search-engine Mascot “publiek”: zonder licentie enkel te bevragen met maximaal 300 dta.files

31

32

33

34

35

36 Na kopieren van merge programma (afkomstig van Mascot-website) in de juiste folder (hier peptide2975 met 299 dta files) wordt 1 grote tekst-file aangemaakt

37 Text-file aanbieden in Mascot

38 invoeren van text-file Welke databank ? Hoe specifiek kan/moet de search zijn?

39 ... en na een 1-2 minuten...

40

41

42

43

44

45

46

47

48

49 Opnieuw dta-fles aanmaken :omdat a) minimizer had enkel de 300 meest intense fragmentatiespectra weerhouden en b) voor slechts een beperkt gebied van het chromatogram nu verder werken met alle dta-files van het volledige chromatogram

50

51

52

53 Alles wat hier ingevuld wordt, wordt weggeschreven in een parameter-file in de folder waar ook de dta-files zich bevinden (vhpeptide2975)

54

55

56

57

58

59

60 b) Dataverwerking 1 ruwe datafile per analyse (per gel spot) a) Data-acquisitie (software: Xcalibur versie 3.1) Raw datafile-format (bestaande uit full scan spectra en fragmentatiespectra) dta-file format (alleen fragmentatiespectra) Mascot Sequest Rapport 1 Rapport 2 (. dat file) (.out file) search (Sequest) Automatiseren Mogelijk ? In welke mate ? Op welke manier ? Transparantie ? Vraagstelling:

61 .dat file en.out file: twee rapporten-> 1 rapport DTAselect software bruikbaar om één rapport te maken (HTML file en een text file als output) ? Kunnen we DTAselect rapport makkelijker manipuleerbaar maken (bv. verwijderen van items en de counter aanpassen,... ) ? Kunnen we DTAselect rapport publicatie-vriendelijk maken ? Automatiseren van download van databanken en extractie van subdatabanken met automatische logboekregistratie (download datum, versie, aantal items per databank) ? Kan Sequest-search vlotter verlopen (geïndexeerde databanken?) [Validatie van identificaties (dmv Lutefisk de novo sequentie-software): belangrijk voor identificaties gebaseerd op slechts één peptide] [Info vervat in full scan spectra] Nauw hierbij aansluitend: Andere vraagstellingen:


Download ppt "PROTEOMICA PROTEOOM = alle prote ïnen die tot expressie worden gebracht door het gen oom, in een bepaald organel, cel, organisme, of lichaamsvloeistof."

Verwante presentaties


Ads door Google