Eiwitzuivering 4 Een praktijkvoorbeeld Specifieke en totale activiteit Recovery en zuiveringsfactor Wat te doen met eiwitten? TBEMH-P05IDB HC8 Sigrid Beiboer

Voorbeeld eiwitzuivering

Inventarisatie van beschikbare gegevens: Strategie eiwitzuivering, een voorbeeld Inventarisatie van beschikbare gegevens: ppPLA2: porcine pancreatic phospholipase A2 Gekloneerd in Escherichia coli als pro-enzym (proPLA2) DNA en aminozuursequentie van proPLA2 is bekend Mature enzym: 124 aminozuren, 14 kDa Prosequentie: 7 aminozuren pI bekend: 6,3 Stabiel eiwit (7 zwavelbruggen): goed resistent tegen bevriezen, ontdooien, bewaren bij KT en pH 4-9 Kristalstructuur is bekend Enzymatische activiteit is bekend

Structuur van PLA2

Enzymatische activiteit van PLA2

Schema eiwitzuivering van PLA2 uit E.coli bacteriecellen Homogenisatie + centrifugatie PLA2 in eiwitmengsel Centrifugatie Ionchromatografie (bij pH 4) Dialyse Ionchromatografie (bij pH 6) Dialyse FPLC + eiwitten

Homogenisatie Triton X-100 toevoegen tot 0,1% eindconcentratie 10 L Kweek medium met bacteriecellen Centrifugeren Sonificatie (3*1 min op ijs) Bacteriecellen in 300 ml TE buffer (pH 8) + 75 gr. sucrose Centrifugeren Resuspenderen Pellet resuspenderen in 400 ml TE buffer 60 mg lysozym toevoegen Mengen, 30 min op ijs Sonificatie (1 min op ijs) 300 ml TE buffer toevoegen Centrifugeren Mengen, 30 min op ijs Pellet met inclusion bodies Sonificeren in 100 ml porties (3*90 sec op ijs)

Hervouwing van proPLA2 7 M guanidine: pellet met inclusion bodies lost op Thannhauser reagens sulfoneert eiwit (S-SO3-) IJsazijn precipiteert eiwit Centrifugatie en wassen van eiwit met water (2x) 8 M ureum: gesulfoneerd eiwit lost op 4 x verdunnen met buffer met cystine en cysteine: 2 M ureum eindconcentratie, hervouwing (o/n, 4ºC) vorming juiste zwavelbruggen Gerenatureerd proPLA2

Activatie van PLA2 CaCl2: PLA2 heeft Ca2+ nodig voor enzymactiviteit pH instellen (8,3) Trypsine: 5% (w/w) eindconcentratie (hoeveelheid proPLA2 geschat met SDS-PAGE) Trypsine knipt prosequentie eraf en activeert PLA2 PLA2 enzymactiviteit volgen met enzymbepaling Geen toename enzym activiteit: - pH naar 4,5 met ijsazijn - trypsine inactief bij pH 4,5

Activatie van PLA2 volgen met bepaling van enzymactiviteit Vrijgekomen vetzuur titreren met loog t = 2 t = 1 Loog (mmol) Enzymactiviteit t = 4 t = 3 Actief PLA2 Tijd (min.)

Zuivering van PLA2 met ionchromatografie Centrifugatie: verwijdering van geprecipiteerd eiwit SP-Sephadex C25 bij pH 4 kolom wassen met 4 kolom volumes NaAc elutie PLA2 met zoutgradiënt (0 – 0,8 M NaCl) Dialyse tegen 5 mM azijnzuur CM-Cellulose bij pH 6 (elutie met 0 – 0,4 M NaCl)

Zuivering met kolom chromatografie Fractieverzamelaar: meet OD280 en geeft dit door aan recorder verschuift buizen in rek met bepaalde snelheid en geeft buiswisseling ook door aan recorder Eiwitoplossing in deze 2 buizen wordt verzameld en gedialyseerd OD280

Activiteit Loog (mmol) mmol loog in 3 min Tijd (min.) t = 0 t = 3 min Stel, 20 ml zuiver PLA2 van 0,117 mg/ml (20 * 0,117 = 2,34 mg PLA2) Enzymbepaling met 300 l geeft 4,05 mol loog/min = 4,05 I.U. 4,05 / 0,3 = 13,5 I.U./ml Specifieke activiteit (S.A.): 13,5 / 0,117 = 115 I.U./mg Totale activiteit: 20 * 13,5 = 270 I.U.

Internationale Units (IU) Definitie: 1 IU is die hoeveelheid enzym die in staat is om 1 mol/min substraat om te zetten of product kan vormen onder omschreven condities (pH, T, substraat, buffer) Vraag: Waarom IU en geen mol/l? Enzym zit in ingewikkeld mengsel. Dus met eiwitbepaling alleen kom je er niet achter hoeveel actief enzym aanwezig is. Met enzymbepaling wel.

Als je een enzymbepaling doet, dan Moet [S].....? Moet de pH.....? Moet de temperatuur.........? Substraat voldoende (= overmaat) aanwezig zijn. (anders meet je geen Vmax, het is dan niet optimaal) In principe [S] = 100x Km (tenzij er substraat remming optreedt) pH en temperatuur dienen optimaal te zijn

Als je een enzymreactie spectrometrisch wilt volgen, dan Moet het substraat absorberen Moet het product absorberen Moeten het substraat en het product absorberen Mogen het substraat en het product niet absorberen Voorkeur voor b (a zou ook kunnen) Afname extinktie in tijd Toename extinktie in tijd Als product en substraat evenveel absorberen, zie je geen toe- of afname extinktie in tijd: extinktie blijft gelijk Extinktie blijft nul in tijd

Vb. kwantificering zuiver ppPLA2 Spectrofotometrisch OD280 Meten tussen OD280 0,1 en 1 en blanco stellen met buffer Tryptofaan, Tyrosine en in mindere mate phenylalanine en alle zwavelbruggen 1 Trp 1*0,4 = 0,4 8 Tyr 8*0,1 = 0,8 5 Phe + 7 S-S = 0,1 E1mg/ml 1,3 OD280 = 0,78  0,78/1,3 = 0,60 mg/ml

Zuivering en recovery Recovery of yield: totale activiteit na bepaalde stap gedeeld door totale activiteit voor zuivering Zuiveringsfactor: specifieke activiteit na bepaalde stap gedeeld door specifieke activiteit voor zuivering

En wat is de totale recovery na de eerste 3 zuiveringsstappen? Per stap Recovery (%) Zuiveringsfactor 100 1 96 3,2 83 6,25 75 3 25 Totaal (begin – einde zuivering): - recovery = 45% - zuivering = 1500 En wat is de totale recovery na de eerste 3 zuiveringsstappen?

Karakterisatie Aminozuur sequentie Drie dimensionale structuur : NMR, X-ray kristallografie Massaspectrometrie Stabiliteit (PLA2: toename tyrosine signaal bij hogere guanidine-HCl concentraties) Biologische activiteit: - affiniteit - enzymactiviteit

Ca2+ affiniteit van PLA2 KCa2+ (mM) S.A. (U/mg) 12,4 0,9 WT ( ) 12,4 0,9 1,6 1,6 WT ( ) Mut ( )

TAA: 1,2,4-triazole-3-alanine pH optimum van PLA2 pI PLA2 6,3 Mut 5,6 TAA is een onnatuurlijk aminozuur: - Lijkt erg op histidine - pKa (TAA) is 4 eenheden lager dan pKa (His) TAA: 1,2,4-triazole-3-alanine

Interface activering van PLA2 Micelvorming: - voldoende substraat - detergens toevoegen

Massaspectrometrie Ionisatie moleculen in gasfase Versnelling ionen in elektrisch veld Scheiding ionen op basis van hun massa/ladingsverhouding Detectie Snel (steeds meer gebruikt, mn ziekenhuizen) Nauwkeurig (dalton)

Bepaling van de ruimtelijke structuur NMR X-ray kristallografie Modelling: homologie (sequentie of functie domein) zoeken met eiwitten van bekende structuur Lysozyme Lactalbumin

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Spectroscopy Atoomkernen van sommige isotopen hebben magnetische momenten Deze is afhankelijk van omgeving Gebruik: - eiwitstructuur bepaling - volgen metabolisme (ziekenhuizen)

X-ray kristallografie

Protein engineering

Protein engineering bij Genencor, Leiden Beste eigenschappen van 2 soortgelijke eiwitten combineren Voorbeeld: alpha amylases met verhoogde stabiliteit, veranderde calcium-bindende eigenschappen en verbeterde werking bij lage pH.

Proteomics in drug discovery

Biochemistry vs. Proteomics