Eiwitzuivering 2 Kwantificeren van eiwitten PAGE en SDS-PAGE Iso-electric focussing 2D PAGE TBEMH-P05IDB HC6 Sigrid Beiboer en Ivo Horn

Kwantificering OD280 of A280 Kleuring door complexvorming Spectrofotometrische bepalingen: waarden tussen 0,1 en 1,0!!!!!!!!!!!! blanco stellen met buffer 2

Kwantificering, OD280 Eiwit absorbeert specifiek bij 280 nm Tyr en Trp en in mindere mate Phe (Y, W en F) pH en T hebben invloed op absorptie Abs. 220 en lager: peptideband in eiwit Afhankelijk van aantal az met ringstructuur! Al in eerder IDB HC van Wd gehad az = aminozuur 3

Kwantificering dmv kleuring Meestal in mg/ml, tenzij precies de code bekend is (dan in molair) Kleuring door complexvorming, vb: Bradford Biureet reactie Folin-Lowry BCA

Kwantificering, Bradford Binding Coomassie Brilliant Blue G-250 aan eiwit Rood, na binding in zuur milieu blauw Meting bij 595 nm Bindt niet i.a.v. bepaalde detergentia, bijv deoxycholaat, triton X-100, NP-40

Kwantificering, Biureet reactie Koperionen binden aan peptidebanden Reductie Cu2+ naar Cu+ OD545 Onafhankelijk van soort aminozuren

Kwantificering, Folin-Lowry Biureetreactie gevolgd door reductie van fosfomolybdaat door Y, W, C, H en peptidebanden Blauwe kleur bij 745 nm Zeer nauwkeurig

BCA bepaling Principe gelijk aan Lowry Door bicinchoninic acid veel gevoeliger Minder gevoelig voor detergentia OD562 en lineair tot OD562=2

Elektroforese, scheiding van eiwitten Moleculaire zeef in gel 9

PAGE: polyacrylamide gel elektroforese Polymerisatie van acrylamide met N,N’-methyleen bisacrylamide mbv katalysator 10

Percentage crosslinker (bisacrylamide) % Crosslinks bepaalt mechanische eigenschappen gel en gemiddelde diameter van de poriën Meestal stockoplossing van acrylamide : bisacrylamide = 29,2 : 0,8 Stockoplossing wordt gefiltreerd (0,4 um) en in donker bij 4ºC bewaard poriediameter 11

Percentage totaal acrylamide Marker: Myosin, 205 kDa Beta-galactosidase, 116 kDa Phosphorylase, B 92 kDa BSA, 66 kDa Egg albumin, 45 kDa Carbonic anhydrase, 29 kDa www.ruf.rice.edu/~bioslabs/studies/sds-page/rf.html (Dalton is gewicht proton) Grote eiwitten laag percentage acrylamide Kleine eiwitten hoog percentage acrylamide 12

Katalysatoren 10% ammoniumpersulfaat (10% APS, bij -20ºC bewaren) en N,N,N’,N’-tetramethyleendiamine (TEMED, donker bewaren bij 4ºC) Aard van katalysator heeft invloed op poriediameter Concentratie van katalysator heeft invloed op structuur van de gel 13

Continue buffersysteem 1 gel, 1 buffer Geen concentrering van eiwitten, dikkere bandjes Kan een beetje voorkomen worden door: sucrose vlak voor monster oplading op de gel op te brengen kleinere ionen uit het monster te halen (dialyse) Betere scheiding door eerst met laag voltage en later met hoog voltage te elektroforeren 14

PAGE met discontinue pH Een discontinu systeem bestaat uit 2 gellagen: Stacking gel: 3% acrylamide, gel met grote mazen. Monster wordt geconcentreerd en eiwitten gerangschikt naar hun mobiliteit Separation / running gel: ±10% acrylamide, gel met kleine mazen, waarin scheiding plaats vindt Tris+ Glycine- pH 8,3 Elektrodevat Tris+ Cl- pH 6,8 Stacking gel Tris+ Cl- pH 8,8 Running gel Kathode Anode Glycine pK aminogroep: 9,8 pK carboxylgroep: 2,4 IEP: (9,8 + 2,4)/2 = 6,1 15

Buffers met verschillende pH regelen de mobiliteit van de elektrolyten pH monsterbuffer en stacking gel zijn gelijk (6,8) IEP van glycine is 6,1 geringe negatieve nettolading traagste elektrolyt in stacking gel Kleine Cl- ion is leidend elektrolyt Hiertussen liggen de mobiliteiten van de eiwitten Rangschikking van eiwitten naar mobiliteit Eiwitzones concentreren zich Grensvlak stacking en running gel toename pH tot 8,3 van elektroforesebuffer Running gel heeft kleine poriën en lage potentiaalgraad: migratiesnelheid van eiwitten neemt sterk af Glycine bij grensvlak: - toename in dichtheid running gel - pH stijging naar 9,5 (glycine wordt sterk negatief) - mobiliteit van glycine neemt sterk toe Scheiding van eiwitten door moleculaire zeefwerking 16

SDS-PAGE SDS-PAGE: Sodium Dodecyl Sulfate - Poly Acrylamide Gel Electrophoresis (Laemmli) SDS geeft eiwitten een negatieve lading Scheiding van eiwitten op molecuulmassa Molecuulmassa bepaling van eiwitten mbv marker Indicatie aantal en hoeveelheid van eiwit (subeenheden) in een monster 17

PAGE van IgG moleculen (antilichamen) Totaal 150 kDa 2 zware ketens van elk 50 kDa 2 lichte ketens van elk 25 kDa (1 dalton = massa 1 proton) Bevat zwavel bruggen tussen: de zware ketens de zware en lichte ketens Natieve PAGE: een brede zone SDS-PAGE: een bandje van 150 kDa SDS-PAGE + DTT: 2 bandjes van 25 kDa en 2 bandjes van 50 kDa 18

SDS-PAGE van IgG moleculen 19

Biorad minigel systeem SDS-PAGE Biorad minigel systeem 20

Gieten van de gel en runnen SDS PAGE op youtube: Pouring the gel http://www.youtube.com/watch?v=EDi_n_0NiF4&feature=fvw Running the gel http://www.youtube.com/watch?v=5eMsgidAY5E&feature=related 21

Gel cassette in elkaar zetten 22

Gieten van de gel 23

Elektroforese cassette 24

Sample buffer bevat de volgende stoffen: Monster laden op gel Sample buffer bevat de volgende stoffen: Broomfenolblauw: hoge mobiliteit, detecteert migratie bufferfront Glycerol: eiwitdaling in slotje SDS Tris buffer pH 6,8 25

Gel wordt gerund bij 40 mA of 100 V Elektroforeren Gel wordt gerund bij 40 mA of 100 V 26

Fixatie om bandverbreding door diffusie tegen te gaan Fixatie en kleuring Fixatie om bandverbreding door diffusie tegen te gaan Kleurmethoden: Coomassie Brilliant Blue R250 (CBB), hergebruik mogelijk CBB in water/methanol/ijsazijn (detectiegrens is 0,2-0,5 ug eiwit) Snellere, groffere, slechtere kleuring: CBB in trichloorazijnzuur Ontkleuring met isopropanol of methanol in azijnzuur Zilverkleuring 10 tot 100 x gevoeliger dan CBB Kleuring niet voor alle eiwitten lineair met concentratie Fluorescerende labels aan eiwitten gekoppeld Radioactieve labels aan eiwitten gekoppeld Immunologische detectie (Western blot) Detectie van enzymen (in H05PBM: 4CIN/waterstofperoxide oplossing  toont alleen peroxidase enzym aan) 27

Resultaat coomassie kleuring 28

Resultaat zilverkleuring 29

Overige kleuring manieren 4CIN/waterstofperoxide oplossing toont peroxidases uit verschillende groenten (H05PBM) Radioactiviteit 30

Vraagje Welke moleculen uit een cel kunnen worden gedetecteerd op SDS-PAGE? Alleen eiwitten van interesse Alle eiwitten Zowel eiwitten als DNA Alles: eiwitten, DNA en overig celmateriaal 31

Isoëlektrisch punt, IEP of pI pH waarbij nettolading van eiwit nul is IEP of pI is afhankelijk van: - aminozuursamenstelling - volgorde van aminozuren 32

Isoëlektrische focussering pH gradiënt over gel aangebracht Samples worden op gel geladen pH op opbrengplek: pH > pI eiwit: eiwit negatief: migreert naar positieve anode pH < pI eiwit: eiwit positief: migreert naar negatieve kathode Migratie van eiwit stopt op die plek waarbij pH = pI Marker mee om pI te bepalen 33

Instelling gradiënt Anode 6H2O O2 + 4H3O+ + 4e- Kathode 4H2O + 4e- 2H2 + 4OH- Verschillende amfolyten worden op gel gebracht Kathode Anode + - + - + - Amfolyt in oplossing: aan de zure kant neemt dit amfolyt protonen op en krijgt daardoor pos. lading en migreert naar kathode; aan basische kant omgekeerde, neg lading en naar anode. Tijdens migratie worden er afhankelijk van de pH protonen uitgewisseld met omgeving en neemt nettolading af. Migratie stopt als pH = pI. Elektroforese gradiënt stelt zich in lineaire pH gradiënt 34

pH bereik Scherpe pH-overgangen aan uiteinden van de gel: bereik van gradiënt komt niet overeen met pH-waarden van de elektrode oplossingen 35

Aandachtspunten zonodig verwijderen met 5% TCA Amfolytconcentratie > 2% Amfolyten mogen niet meekleuren zonodig verwijderen met 5% TCA Spanning (V) zo hoog mogelijk instellen na instelling pH gradiënt, runnen op constant vermogen (bijv. 30 Watt) 36

Voorbeeld Isoëlektrische focussering 37

2D-elektroforese 1. Isoëlektrische focussering 2. SDS-PAGE 38

Resultaat 2D-elektroforese Via http://us.expasy.org en SWISS-2DPAGE nog meer 39

Welk eiwit? Marker nodig Afstanden meten; schatten visueel Computer software Internet database Vergelijkbare 2D gels myoglobine PC, database

Bepaling molmassa of pI mbv afstanden meten H05PBM, Bepaling molecuulgewichten van peroxidases: Meet de afstand van de bovenkant van de separating gel tot aan de blauwe band (=frontlijn) in cm. Dit is de R0 waarde Bepaal eerst de Rf waarde van elk bandje van de marker. Bepaal de Rf-waarde door de afstand tussen bovenkant van de separating gel tot aan het bandje te meten (R waarde) en deze te delen door de R0-waarde. De Rf = R/R0. Maak een ijklijn van de Rf waarde (x-as) tegen de logaritme van het molecuulgewicht van het eiwit in de marker (y-as). Gebruik de formule die de ijklijn beschrijft om het molecuulgewicht van de peroxidases te bepalen.

Wilson & Walker, Campbell & Farrell 7e editie H3: 3.1-3.4.2 H8: 8.1-8.3.4 H10.2.2-10.3.5 & 10.3.7 H11:11.1.1-11.1.2, 11.2.1-11.2.2, 11.6-11.8.2 & 11.8.4 7e editie H5: 5.1-5.3 H5: 5.4 lezen W&W H11 gaat over chromatografie, wat in IDB HC7 wordt behandeld