KULeuven: fermentatie van hydrolysaat TETRA Vergadering Gebruikersgroep IV Project 80108: Valorisatie van (ligno-)cellulose reststromen - VaLiCel KULeuven: fermentatie van hydrolysaat

Materiaal en Methoden voorbehandeld materiaal gehydrolyseerd materiaal Vlaslemen voorbehandeld materiaal Voorbehandeling: Zeven Wassen met 60% EtOH en water droog nat Saccharificatie: Organosolv 3 d roeren bij 50°C 3 d schudden 150 rpm 50°C gehydrolyseerd materiaal HoGent MCB/KULeuven Inactivatie van enzyme 5 min 70°C gehydrolyseerd Materiaal + gist Fermentatie

Materiaal en Methoden Fermentatie voorgroei gist Hydrolysaat In YPD tot stationaire fase tellen -> concentratie Hydrolysaat enzyme inactiveren ethanol en suiker bepalen hydrolysaat: 80 mL per fermentatiebuis; controle: YP 4.2% glucose inoculeren met 6.3 x 106 cellen/mL fermentatie: 25°C; continu roeren volgen a.h.v. gewichtsverlies (dr. CO2 productie) op het einde: afkoelen; minimum 1 dag 4°C “bier”: centrifugatie -> gist in neerslag (verwijderen) supernatans -> ethanol; suiker (glucose en andere) “cake”: cellen in suspensie -> viabiliteit

Bevat 4.2% glucose en 0.69% xylose Fermentatie reeks 1 3 stammen (S. cerevisiae) 3 media gecentrifugeerd hydrolysaat YP - 4.2%glc (niet aangezuurd) hydrolysaat Bevat 4.2% glucose en 0.69% xylose

Fermentatie reeks 1 3 stammen (S. cerevisiae) 3 media 05022010

Gecentrifugeerd hydrolysaat Fermentatie reeks 1: resultaten 1. Fermentatiesnelheid YP glucose Gecentrifugeerd hydrolysaat hydrolysaat

Fermentatie reeks 1 2. Ethanol productie: met Anton Paar Beer Alcolyzer Plus 3. Xylose concentratie: HPAEC-PAD, HoGent 4. Viabiliteit: met FACScan

Fermentatie reeks 1: resultaten

Fermentatie reeks 1: resultaten Eth.r PE2 Xyl 05022010

Uit 4.22% glucose: 2.72% EtOH maximum Fermentatie reeks 1 Berekening Uit 4.22% glucose: 2.72% EtOH maximum Bekomen: waarden voor fermentatie in YP-4.2% glucose: rond 2.2% ethanol waarden voor fermentatie in hydrolysaat: rond 3.3% ethanol

- Analyse hydrolysaat (HPLC) Fermentatie reeks 1 - Analyse hydrolysaat (HPLC) “Dextrose”: 5.1% “fructose”: 1.1% “C6 suikers”: 6.2% -> 3.99% ethanol verwacht “maltose” ??

Fermentatie reeks 1 Besluiten de suikers van het vlaslemen hydrolysaat worden goed gefermenteerd de fermentatie verloopt trager dan in YP-glucose bij één stam heeft het hydrolysaat een (lichte) daling van de viabiliteit tot gevolg de fermentatie in het volledige hydrolysaat verloopt nog trager dan in het afgecentrifugeerde, maar de ethanolproductie is vergelijkbaar de stam die een cassette bevat om xylose te fermenteren doet het niet beter dan de andere stammen (maar xylose is heel laag)

Fermentatie reeks 2 7 stammen media: - YP + 4.2% glucose, aangezuurd tot pH 4.8 - gecentrifugeerd hydrolysaat

Fermentatie reeks 2: resultaten 1. Fermentatiesnelheid 05022010

Fermentatie reeks 2: resultaten 1. Ethanol productie; viabiliteit 05022010

Fermentatie reeks 2 Besluiten alle stammen kunnen het hydrolysaat goed fermenteren, maar met duidelijk verschillende snelheden en enigszins verschillend rendement de ethanolproductie is vergelijkbaar met deze van de vorige fermentatie de viabiliteit in YPglucose is iets lager dan in de 1° fermentatie, waarschijnlijk te wijten aan het zuurder medium de viabiliteit in hydrolysaat ligt tussen 75 en 95%

Algemene besluiten de fermenteerbare suikers vrijgezet door hydrolyse van vlaslemen kunnen goed gefermenteerd worden dit is een indicatie voor geen of weinig inhibitoren in het hydrolysaat ook de viabiliteit wijst op weinig inhibitoren (de lichte daling is waarschijnlijk te wijten aan de lage pH; cfr. de resultaten in YPglucose pH 4.8) verschillende giststammen vertonen verschillende fermentatiesnelheden en een verschillend rendement; bij meer geconcentreerd hydrolysaat waarschijnlijk nog meer uitgesproken screenen van een grotere collectie stammen zal nodig zijn om één of meer stammen te vinden die meer geconcentreerd hydrolysaat snel en efficiënt kunnen fermenteren stammen die het goed doen met één substraat doen het niet noodzakelijk goed met een ander (vergelijk YPglucose aangezuurd tot pH 4.8, met hydrolysaat)

Verdere proeven HPLC op hydrolysaat vóór en na fermentatie -> meer compleet suikerpatroon Indien mogelijk, van meer geconcentreerd hydrolysaat vertrekken -> > 5% ethanol eindconc. Hydrolysaat met YPglucose mengen -> fermentatie en ethanolproductie vergelijken met YPglucose zonder hydrolysaat YPglucose met verdund hydrolysaat Doel: om mogelijke inhiberende werking van het hydrolysaat op de fermentatie van media met een hoger suikergehalte na te gaan (toevoegen aan eerste generatie bioethanol substraten mogelijk ?) 05022010

Speciale dank aan Thomas Talpe Robert Olson, Dieter Depuydt Medewerkers van MCB IWT