Optimalisatie van HRMCA toepassingen Genotypering BRCA1/2 SNP’s Mutatiescanning NF1 Goeiedag, ik zal het hebben over de optimalisatie van 2 HRMCA toepassingen. Genotypering van BRCA1/2 SNP’s en mutatiescanning van het NF1 gen. Filip Slabbinck Filip Slabbinck

Overzicht Inleiding Borstkanker Neurofibromatose type 1 Technieken: HRMCA Mutatiedetectie Genotypering met behulp van ongelabelde probes Resultaten Conclusie Ik zal vooreerst een korte inleiding geven. Daarna zal ik kort borstkanker en NF1 bespreken. Vervolgens komen beide technieken aan bod waarna een bespreking volgt van de resultaten. Als laatste wordt een conclusie gegeven. Filip Slabbinck

Inleiding en doelstelling BRCA1/2 gescreend dmv High Resolution Melting Curve Analysis (HRMCA) NF1 gescreend dmv directe sequenering op cDNA  omslachtig en arbeidsintensief Algemene doelstelling: optimaliseren van 2 HRMCA toepassingen Genotypering mbv ongelabelde probes van BRCA1/2 SNP’s Mutatiescanning van het NF1 gen De genen geassocieerd met een verhoogd risico op borstkanker worden gescreend door middel van HRMCA. Dit is een techniek gebaseerd op analyse van het smeltprofiel dat ontstaat bij het uiteensmelten van DNA. Door middel van mutatiescanning kunnen patiënten met een verhoogd risico geïdentificeerd worden. De methode gebeurt op de LightScanner en maakt gebruik van een fluorescente verzadigende kleurstof (LCGreen) die na smelten een specifieke smeltcurve weergeeft. Door het polymorf karakter van deze genen dient er nog steeds een groot aantal variaties gesequeneerd te worden. Neurofibromatose type 1 wordt gescreend door middel van directe sequenering op cDNA niveau. Deze techniek is omslachtig en arbeidsintensief. De algemene doelstelling van deze stage en thesis is het optimaliseren van 2 HRMCA toepassingen. Namelijk genotypering met behulp van ongelabelde probes voor de karakterisatie van frequente BRCA1/2 SNP’s en de mutatiescanning van het NF1 gen. Filip Slabbinck

Borstkanker Incidentie 2e grootste doodsoorzaak meest voorkomende kanker bij vrouwen Risico-ontwikkeling: ± 1 op 10 1% borstkankerpatiënten zijn mannen Borstkanker is in vele westerse landen de grootste doodsoorzaak. Het is tevens een van de meest voorkomende kanker bij vrouwen. Het risico om borstkanker te ontwikkelen bedraagt wereldwijd 1 op 10, in België is dat 1 op 8. Dit risico is afhankelijk van omgevings- en genetische factoren. Borstkanker komt in kleine mate ook voor bij mannen. Ze vertegenwoordigen 1% van alle borstkanker patiënten. Filip Slabbinck

Borstkanker Genetische gevoeligheid 80% sporadische kanker 5-10% genetische oorzaak Onderscheid erfelijke en familiale borstkanker Erfelijk 5-8% alle borstkankers Autosomaal dominant 80% families een BRCA-mutatie Verhoogd risico op ovariumkanker Familiaal 15% alle borstkankers 15-30% families een BRCA-mutatie verhoogd risico op ovariumkanker 1 van de belangrijkste en meest bestudeerde risicofactoren is de genetische gevoeligheid. Ongeveer 80% van alle borstkankers zijn sporadisch. In 5 tot 10% van alle borstkankerpatiënten kan een genetische oorzaak aangetoond worden. Er wordt een onderscheid gemaakt tussen erfelijke en familiale borstkanker, respectievelijk geassocieerd met een minder sterk en een sterk verhoogd risico. Erfelijke borstkanker vertegenwoordigt 5-8% van alle borstkankers. Het overervingspatroon is autosomaal dominant. Familiale borstkanker vertegenwoordigt 15% van alle borstkankers. Bij deze families komt borstkanker vaker voor op jongere leeftijd in vergelijking met de normale populatie. In 20-30% van de families komt een BRCA mutatie voor. Beiden hebben een verhoogd risico op ovariumkanker. Filip Slabbinck

Borstkanker BRCA1/2 BRCA1 BRCA2 Tumorsuppressorgenen Positie: 17q21 24 exonen BRCA2 Positie: 13q12.3 27 exonen Tumorsuppressorgenen Verantwoordelijk voor 70-80% van alle erfelijke borstkankers Personen met mutatie  verhoogd risico Tot op heden zijn 2 genen gekend die bij defect verantwoordelijk zijn voor de ontwikkeling van borstkanker. Deze zijn BRCA1 en BRCA2. Beide genen zijn tumorsuppressorgenen. Een verhoogde expressie van van de BRCA proteïnen in de tumorcellijnen inhibeert de celgroei en de celdeling. Beide genen zijn verantwoordelijk voor een klein percentage van alle borstkankers, maar voor 70-80% van alle erfelijke borstkankers. Personen die drager zijn van zo’n mutatie hebben een sterk verhoogd risico op de ontwikkeling van borstkanker. Filip Slabbinck

Neurofibromatose type 1 (NF1) Klinische aspecten en diagnostische criteria Neurofibromatose type 1 of ziekte van Von Recklinghausen Autosomaal dominant NF1 tumorsuppressorgen Variabele expressie Neurofibromatose type 1 is een autosomaal dominante aandoening veroorzaakt door defecten in het NF1 tumorsuppressorgen. Wereldwijd komt deze aandoening voor bij 1 op de 3500 individuen. De aandoening heeft een variabele expressie. De meest voorkomende kenmerken zijn pigment abnormaliteiten zoals café-au-lait spots die rechts op de figuur te zien zijn. Een ander veel voorkomend kenmerk is de aanwezigheid van neurofibromen. Dit zijn complexe goedaardige tumoren. Deze tumoren zijn meestal afwezig bij de geboorte en verschijnen voor het eerst rond de puberteit. De neurofibromen worden onderverdeeld in 2 types, de concrete neurofibromen en de plexiforme neurofibromen waarvan een voorbeeld te zien is op de linkse figuur. Filip Slabbinck

Neurofibromatose type 1 (NF1) NF1 gen Positie: 17q11.2 60 exonen Mutatie analyse  moeilijk Het NF1 gen is gelegen op chromosoom 17 band 11.2. Het is een groot gen, het omvat 60 exonen. Mutatie analyse van dit gen is moeilijk vanwegen de grootte van het gen en het voorkomen van pseudogenen. Filip Slabbinck

Technieken: HRMCA LCGreen Plus dsDNA-verzadigende fluorescente kleurstof HRMCA is een mutatiedetectietechniek gebruikt voor de detectie van sequentievariaties. De detectie gebeurt met behulp van de kleurstof LC Green Plus. LCGreen Plus is een dsDNA-bindende, fluorescente kleurstof en wordt gebruikt in verzadigende vorm. Op de figuur wordt een verschil weergegeven tussen het gebruik van LCGreen en SYBR Green. LCGreen is in verzadigende vorm gebonden met dsDNA. Na denaturatie komt dit LCGreen vrij. Doordat de kleurstof over de gehele lengte van het dsDNA ingebouwd is ontstaan er geen openingen zoals te zien is bij SYBR Green. Indien er openingen gevormd zouden worden, zou de kleurstof bij denaturatie verspringen naar een opening in plaats van vrij te komen in het milieu. Dankzij deze verzadigende eigenschap kunnen heteroduplexen gedetecteerd worden tijdens smeltanalyse. Filip Slabbinck

Technieken: HRMCA Mutatiedetectie met HRMCA Principe: thermostabiliteit T : dsDNA denatureert  ssDNA Smeltcurve: fluorescentie uitgezet tov temperatuur 100% fluorescentie 0% fluorescentie Het principe van mutatiedetectie met HRMCA steunt op de thermostabiliteit van het PCR product. LCGreen wordt in het dsDNA geïntercaleerd en de amplicons worden onderworpen aan een stijgende temperatuur. Naarmate de temperatuur stijgt denatureert het dsDNA tot 2 enkele strengen DNA. LCGreen komt vrij naarmate de temperatuur stijgt en naarmate de 2 strengen uit elkaar gaan. Bij 100% fluorescentie is het amplicon volledig dubbelstrengig, bij 0% is het volledig enkelstrengig. Wanneer een amplicon een sequentievariatie draagt, zullen de strengen op een lagere temperatuur uit elkaar gaan dan het homozygoot perfect gepaarde DNA. In de smeltcurven wordt de fluorescentie uitgezet ten opzichte van de temperatuur. Filip Slabbinck

Technieken: HRMCA Genotypering mbv ongelabelde probes Eenvoudig en snel Asymmetrische PCR Probelengte: 20-30 bp Genotypering met ongelabelde probes is een andere toepassing van de HRMCA. De techniek is eenvoudig, snel en kan de meeste SNP’s detecteren. De methode vereist twee primers, een ongelabelde probe en een verzadigende kleurstof. De PCR reactie verloopt asymmetrisch, dit wil zeggen dat 1 primer in overmaat wordt toegevoegd. De streng waartegen men de probe legt is vrij in keuze. Voorbeeld, wordt de probe tegenover de antisense streng (B) gelegd zoals te zien is op de figuur, dan moet de primer in overmaat zorgen voor een vergrote hoeveelheid kopies van deze antisense streng. De probe hybridiseert met de regio waar de sequentievariatie zich bevindt. Het is ook deze regio die gegenotypeerd moet worden. Er kunnen 2 soorten duplexen ontstaan: heteroduplexen en homoduplexen. Na PCR wordt een overmaat probe-amplicon duplexen gevormd en een kleine hoeveelheid amplicon duplexen. Beide duplexen geven een verschillende smeltcurve die samen in 1 beeld kunnen bekeken en geanalyseerd worden. Probes met een lente tussen de 20 en 30 baseparen produceren het beste signaal. Filip Slabbinck

Resultaten Genotypering mbv ongelabelde probes CC TT CT 4 genotyperingsprotocols geoptimaliseerd Belangrijke parameters: Ta, DMSO en aantal cycli SNP c.562-34 C>T BRCA1 8: Ta 53°C, 50 cycli en 3% DMSO SNP c.2201 C>T BRCA1 11.8 en 11.9 Ta 58°C, 50 cycli: links BRCA1 11.8, rechts BRCA1 11.9 CC TT CT Als resultaat voor genotypering met behulp van ongelabelde probes werden 4 genotyperingsprotocols geoptimaliseerd. De belangrijkste parameters die gebruikt worden zijn de anealing temperatuur, de concentratie DMSO en het aantal cycli tijdens PCR. De eerste SNP is geoptimaliseerd met een anealingtemperatuur van 53°C, 50cycli en 3%DMSO. DMSO wordt gebruikt als hulpstof voor de ontbinding van het dsDNA en zorgt er ook voor dat de strengen niet te snel onderling binden. Bij de 2e en 3e SNP is er geen gebruik gemaakt van DMSO. De anealingtemperatuur is de enige parameter die verandert is. Deze ligt op een temperatuur van 58°C. CC CT TT CC TT CT Filip Slabbinck

SNP c.7470 G>A BRCA2 14.2 Ta 53°C, 55 cycli 1 probe  verschillende SNP’s (vb. SNP c.2201 C>T en SNP c.2196 G>A) GG AA GA Legende: GA (heterozygoot) GG (homozygoot wild type) CC (homozygoot wild type) CT (heterozygoot) TT (homozygoot variant) Voor de 4e SNP is in vergelijking met de eerste SNP enkel het aantal cycli verandert. Deze zijn verhoogt tot 55. Bij deze SNP zorgt het verhogen van het aantal cycli voor een betere specificiteit van de DNA-strengen. Dit zorgt ervoor dat de strengen mooi binden met elkaar en dat de probe niet te vroeg van het amplicon komt. Als bijkomende test werd nagegaan of verschillende SNP’s gelegen onder 1 probe samen konden gedetecteerd worden. Het resultaat was positief. Op de figuur is het resultaat te zien van 2 SNP’s die 5 baseparen van elkaar gelegen zijn. Filip Slabbinck

Validatie dmv een blinde screening 95 patiënten 3 SNP’s met 100% accuratie detectie CC TT CT Om alle geoptimaliseerde resultaten te bevestigen wordt een validatie gedaan door middel van blinde screening. Daarbij wordt op 95 willekeurige stalen getest. Drie SNP’s werden gedetecteerd met een gevoeligheid van 100%. Voor 1 SNP was de kwaliteit van de analyse van 2 DNA-stalen te laag om correct geïnterpreteerd te worden. Filip Slabbinck

Resultaten Mutatiescanning van het NF1 gen 11 van de 60 exonen geoptimaliseerd met PCR55 Exon 2 geoptimaliseerd na sequeneren Na sequeneren rode curven = SNP (c.168 C>T (p.Ser56Ser)) Belangrijke parameter: lengte Validatie van ieder exon gebeurt met positieve en negatieve controles Voor mutatiescanning van het NF1 gen werden 11 van de 60 exonen geoptimaliseerd op een annealing temperatuur van 55°C. Als resultaat moet een vlak profiel zonder afwijkende curves op de LightScanner bekomen worden en een specifiek bandje op agarosegel. Exon 2 is geoptimaliseerd na sequeneren. Op het sequentieprofiel wordt gezien dat de rode curves overeenkomen met een polymorfisme. Om de geoptimaliseerde fragmenten te bevestigen wordt op ieder fragment een validatie uitgevoerd met positieve en negatieve controles. Een zeer belangrijke parameter bij deze optimalisatie is de fragmentlengte. De kritieke grens ligt op 450bp. Filip Slabbinck

Conclusie HRMCA Genotypering mbv ongelabelde probes Eenvoudig Snel Goedkoop gevoelig Genotypering mbv ongelabelde probes Doorgedreven optimalisatie is vereist Mutatiescanning van het NF1 gen Toekomst: na validatie  overschakeling naar HRMCA Algemeen Optimalisatie HRMCA protocols  sterke reductie sequeneren De optimalisatie van beide HRMCA toepassingen gebeuren op de LightScanner. HRMCA is een eenvoudige methode, snel in analyse, goedkoop en zeer gevoelig. Voor de genotypering wordt gebruik gemaakt van ongelabelde probes. Deze methode vereist een doorgedreven optimalisatie, die enkel loont voor frequente SNPs die dienen gedetecteerd te worden voor een voldoende groot aantal patiënten. Voor mutatiescanning van het NF1 gen zal in de toekomst overgeschakeld worden van directe sequenering op cDNA niveau naar HRMCA voor alle exonen op gDNA niveau. Voor de geteste stalen werd een 100% gevoeligheid bekomen. De optimalisatie van deze 2 HRMCA protocols zal resulteren in een sterke reductie van het aantal te sequeneren fragmenten in vergelijking met de vroeger toegepaste methodes. Filip Slabbinck

Dank aan Kathleen Claes Mieke Demeyere Kim De Leeneer Ilse Coene Justine Simkens Filip Slabbinck