Darm Microbiota – alles wat je wilt weten over wat in ons groeit en bloeit 13 Januari 2012, Hauke Smidt

In the following 30 minutes or so I would like you to join me on a journey exploring and exploiting the microbial worlds inside and around us. I will introduce you to the “sailing vessels” allowing this journey – the Beagles of modern microbial ecology if you wish, which have become available to us thanks to the genomic revolution of the past decade or so. First, we will embark on a Fantastic Voyage to the microbes close to our heart –myriads of microorganisms that can be found in the gastrointestinal tract of humans, as well as farm animals, such as pigs, poultry and cattle, but also farmed fish, and that are intimately linked with intestinal and systemic health and disease of their host organisms. Changing vessels, we will take a glimpse of the enormous microbial diversity associated with invertebrates inhabiting freshwater and marine environments, and how we can explore this diversity for biotechnological purposes and environmental monitoring. Last but not least, we will get our feet back on the ground, and I hope to convince you that microbes can even be exploited for the efficient clean-up of environments that are heavily polluted by human activities, and that we can use molecular ecological approaches to understand and optimize these so-called bioremediation processes. dailymail.co.uk 2 2-02-12 Fantastic Voyage LA Times.com

De wereld in ons – het darm ecosysteem Talking about gut bacteria these days can of course not be done without talking about the devestating outcome of the recent outbreak of Escherichia coli O104:H4 that has and still is keeping most Germans to hold their breath. A little short of 40 casualties and several 1000 infections, in many cases with life-long impact on health and well-being. And who of us hasn’t heard about MRSA and ESBL bacteria - or in other words the increasing spread of antibiotic resistance in bacteria that colonize humans and farm animals. 3 2-02-12 De wereld in ons – het darm ecosysteem Pathogene darm bacteriën zijn voorpagina nieuws Zorgen over een toenemende verspreiding van antibiotica resistentie in bacteriën in mens & dier tagesschau.de

De wereld in ons – het darm ecosysteem But there is more to the microbial world than those nasty micro-organisms that can cause life-threatening diseases in humans, animals and plants. This is an artist’s & microbial ecologist’s impression of the microbial diversity that you would encounter for example in the gastrointestinal tract of humans - or more practically spoken, in a stool sample – You see all kinds of shapes – from more or less long rods to little balls, also termed cocci that appear in different forms of aggregation, spirals...well...you see for yourself.... It’s impressive, right...but what if I would tell you now that there is still more to the diversity of microorganisms in the intestinal tract of us, our cats and dogs, pigs, poultry, cows, fish,....and believe it or not, even in the guts of those little critters that our colleagues at the Laboratory of Entomology like to study. 4 2-02-12 De wereld in ons – het darm ecosysteem Maar er is meer.... Antoon Akkermans – impressies van een kunstenaar & microbiëel ecoloog

De wereld in ons – het darm ecosysteem 2-02-12 5 De wereld in ons – het darm ecosysteem 10x meer micro-organismen dan humane cellen Meer dan 1000 verschillende micro-organismen in de darm Maag & duodenum (103-105 bacteria/g) Dunne darm (104-108 bacteria/g) Dikke darm (1010-1012 bacteria/g) ontlasting (1010-1012 bacteria/g) Toename in microbiota- & voeding-geassocieerde aandoeningen IBD, allergie, obesitas…

Wat doen de micro-organismen in de darm? 6 2-02-12 Wat doen de micro-organismen in de darm? Vertering van voedsel & leveren van nutriënten Korte keten vetzuren (azijnzuur, propioonzuur, boterzuur) Aminozuren Vitamines Beïnvloeden darm morfologie en fysiologie Bescherming tegen pathogene MOs

Waar zitten de micro-organismen in de darm? 2-02-12 Waar zitten de micro-organismen in de darm? Investigating all of these important issues, however, have in the past been seriously hampered by the fact that we are still far from being able to cultivate all of the micro-organisms that occur in the intestine – or any other microbial ecosystem. 7

Het “Gouden Driehoek” van de interacties in de darm 2-02-12 8 Het “Gouden Driehoek” van de interacties in de darm Fysiologie en vertering Microbiële Ecologie Gezondheid & Performance Mucosale barrière & immuunsysteem

Microbiële Ecologie – een definitie 9 2-02-12 Microbiële Ecologie – een definitie Studie van de interacties van micro-organismen onderling en met hun leefomgeving Fysisch-chemisch (bijvoorbeeld +/- zuurstof) Biologisch (gastheer)

De meeste MO’s zijn nog niet gekweekt 2-02-12 De meeste MO’s zijn nog niet gekweekt “kweekbaar” Darm 10-50% Actief slib 1-15% Bodem <1% Zeewater <0.1% Incompleet plaatje van microbiële diversiteit en functie Investigating all of these important issues, however, have in the past been seriously hampered by the fact that we are still far from being able to cultivate all of the micro-organisms that occur in the intestine – or any other microbial ecosystem. Amann et al., 1995. Microbiol. Rev. 59:143-169 1010

Geïntegreerde benadering 1111 Microbiota kweken Uitplaten op (selectieve) voedingsbodems Fysiologische karakterisatie API BIOLOG … Kweek-onafhankelijk Moleculaire markers (Celbestanddelen) Geïntegreerde benadering Vaak langdurig onderzoek Voor lang niet alle MO’s zijn er selectieve media Veel MO’s zijn (nog) niet te kweken

Moleculaire markers – wat zijn de keuzes? 2-02-12 1212 Moleculaire markers – wat zijn de keuzes? Oppervlakte moleculen Eiwitten Membraan lipiden (Metabolieten) DNA RNA rRNA is onderdeel van de ribosomen – de eiwit fabriekjes in alle levende cellen RIBOSOOM

Microbiële biomarkers voor ecosysteem functie 2-02-12 Moleculaire Microbiële Ecologie Wie is er? Wat doen ze? Wat kunnen ze? Microbiële biomarkers voor ecosysteem functie 1313

De meeste MO’s zijn nog niet gekweekt 2-02-12 De meeste MO’s zijn nog niet gekweekt In order to eleviate this restriction in our ambition to understand microbial behaviour in the environment, we need methods that are independent of cultivation. Here, biomolecular methods, and these days, those are to a large extend genomics-driven approaches, have shown to be most appropriate, allowing us to realize the scientific “castles in the air- luchkastelen – Luftschlösser” that we dream of in our day dreams. R. Magritte Nieuwe kweekmethodes & Moleculair-biologische benaderingen 1414

Microbiële biomarkers voor ecosysteem functie 2-02-12 Moleculaire Microbiële Ecologie Wie is er? Wat doen ze? Wat kunnen ze? Microbiële biomarkers voor ecosysteem functie 1515

De 16S ribosomaal RNA Benadering in de Microbiële Ecologie 1616 De 16S ribosomaal RNA Benadering in de Microbiële Ecologie V1 V2 V3 V4 V5 V7 V8 V9 V6 16S RNA Ideale fylogenetische marker Bevat verschillende maten van conservering Voldoende informatie, om verschillende soorten te onderscheiden In alle levende cellen aanwezig Ruim 2,000,000 sequenties in databanken beschikbaar 1 kb 16S rRNA 5S rRNA 23S rRNA tRNA-Glu 1 2 3 4 5 6 7 8 9 DNA

De Tree of Life zoals we hem hebben geleerd 1717 2-02-12 De Tree of Life zoals we hem hebben geleerd

DeTree of Life sinds Carl Woese (1977) 2-02-12 1818 DeTree of Life sinds Carl Woese (1977) Bacteria Archaea Gebaseerd op rRNA sequenties Eucarya

1919 Amplificeren van rRNA genen door middel van PCR (polymerase keten reactie) Design of primers Universeel Alle micro-organismen Specifiek (selectieve primers) Voor bepaalde micro-organismen

Welke Micro-organismen zitten in de Humane Darm? 2020 2-02-12 Welke Micro-organismen zitten in de Humane Darm? Rajilić-Stojanović et al., 2007. Env. Microbiol.

Welke Micro-organismen zitten in de darm? 2121 2-02-12 Welke Micro-organismen zitten in de darm?

Intestinal Verrucomicrobia Isolates Akkermansia muciniphila 2222 Intestinal Verrucomicrobia Isolates Akkermansia muciniphila A.muciniphila (2.7 Mb) Dedicted to growth on mucus Derrien et al., IJSE M 54 (2004) 1469-1475 22

Unique Intestinal Mucus-Degrading Genus 2323 Unique Intestinal Mucus-Degrading Genus Akkermansia Akkermansia muciniphila: only intestinal species belonging to the Verrucomicrobia ~ 1 mm dedicated mucin-utilizers A. muciniphila – Abundantly Present Along the GIT Ileum ~ 5 % Rectum ~7 % Feces 1-3 % Derrien et al., AEM 74 (2008) 1646 -48 23

A. muciniphila Shows Unique Spatial Intestinal Organization 2424 A. muciniphila Shows Unique Spatial Intestinal Organization Sigmoidal Gut Covered with Akkermansia-like Bacteria Intimate Contact Colonic Mucosa Recent Observations on Akkermansia-Like Phylotypes Abundant Normal Appendix But Decreased in Appendicitis - Swindinski et al Gut 2010 Decreased Highly in IBD Mucosa as Compared to Healthy Mucosa – Png et al 2010 Reduced 10-fold in Pregnant Woman with High Compared to Normal Weight Gain – Santacruz et al BJN 2010 FISH with Total (Cy3) & Muc (Cy5) Probes - courtesy Alexander Swindinski Mucosal Response ? 24

De 16S rRNA Benadering in de Microbiële Ecologie 2525 De 16S rRNA Benadering in de Microbiële Ecologie Darm monster (feces) DNA PCR kwantitatieve PCR 16S rRNA gen 16S rRNA gen Sequentie analyse DGGE / T-RFLP / X-CHIP Vingerafdrukken microbiële diversiteit Kwantificering van specifieke populaties

De eerste 2 maanden van een baby 2626 De eerste 2 maanden van een baby 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12 14 16 20 50 DAYS C D A B E A = E.coli C = Ruminococcus gnavus 96 % ID B = Enterococcus avium 98 % ID D = Clostridium puniccum 93 % ID E = Bifidobacterium breve 97% ID Favier et al., 2002. AEM 68:219-226.

Ontlastingsanalyse van volwassenen 2727 Ontlastingsanalyse van volwassenen Zoetendal et al., 1998. AEM 64:3854-3859 M A B D C 2 4 (months) 4 Complex, stabiel en uniek

Correlatie genotype - microbiota 2828 Correlatie genotype - microbiota Variatie in de tijd (N=4) Eeneiige tweelingen (N=6) Getrouwd (N=12) Niet gerelateerde personen (N=17) Mens vs. aap (N=4) Zoetendal et al., 2001. Microb. Ecol. Health Dis. 13:129-134

Voeding is ook belangrijk 2929 Voeding is ook belangrijk Elk puntje representeerd één diersoort Hoe hoger de overeenkomst, hoe dichterbij in plaatje Invloed van diëet & genotype (Ley et al., 2008, Science)

Nieuwe tools beschikbaar Intestinal Tract Chip Suite 2-02-12 3030 Nieuwe tools beschikbaar Intestinal Tract Chip Suite HITChip MITChip PITChip V1 V2 V3 V4 V5 V7 V8 V9 V6 CHICKChip

2-02-12 3131 X-Chip kombineert fylogenetische fingerafdruk met informatie over samenstelling DNA extractie 16S rRNA gen amplificatie Labelling monsters (microbiota) hybridisatie X-Chip: Data analyse Diversiteits-analyse Multivariate statistiek (RDA/PCA) Phylotype clustering Profiling Identificatie Quantificering

HITChip Fingerprinting - Babies / Volwassenen 3232

Microbiota in gezonde volwassenen in de tijd 3333 Microbiota in gezonde volwassenen in de tijd Microbiota is uniek per persoon en stabiel in de tijd (4 jaar)

3434 2-02-12 Some are more equal than others... Dynamica van microbiota in gezonde volwassenen Zelfs na 4 jaar: individu-specifieke microbiota Microbiota van tweelingen lijkt meer op elkaar dan van niet verwandte personen (p=0.06)

Microbiota stabiliteit – is er een geconserveerd deel ? 2-02-12 3535 Microbiota stabiliteit – is er een geconserveerd deel ? Éen individu in de loop van 10 jaar Vergelijking van ~1000 individuen Common Networks rather than Common Core Nikkila & de Vos JCM (2010) 44: S2-S5 Individual Core Rajilić-Stojanović, 2007. PhD thesis.

Drie geconserveerde netwerken in de populatie 2-02-12 3636 Drie geconserveerde netwerken in de populatie Enterotypes gebaseerd op metagenomen En HITChip analyses Samenstelling functie Kunnen wellicht verschillend reageren op interventie (medicatie / voeding) Amurugam et al., 2011. Nature

Microbiota in Colitis (UC) Patiënten 3737 Microbiota in Colitis (UC) Patiënten Gezond UC

Microbiota in Colitis (UC) Patiënten Healthy individuals and IBD patients have distinct microbiota (p=0.002) Principle Component Analysis (PCA) Healthy UC 3838

IBD vs. IBS IBS-associated microbiota not that special? Gezond UC/IBS 3939 IBD vs. IBS Gezond UC/IBS IBS-associated microbiota not that special?

Microbiota & Prikkelbaar Darm Syndroom Wijd versprijd & Grote Impact in Maatschappij Relevant Pharma & Food Mogelijkheden voor Probiotica Interventie L.rhamnosus GG & Lc705; B.animalis BB12; P.freudenreichii JS 40 4040

Verschillen Microbiota ‘IBS’ & ‘Gezonde’ Individuen Identificatie van potentiële biomarker soorten (Kassinen et al 2007) 41 4141

IBS Studie– Kajander et al 2008 voor microbiota analyses fecal materiaal voor microbiota analyses placebo probiotic 42 4242

Probiotische Correctie van Gereduceerde Stabiliteit B/C minus A/B Probiotic Placebo A/B B/C 43 4343

Microbiële biomarkers voor ecosysteem functie 2-02-12 Moleculaire Microbiële Ecologie – Nieuwe ontwikkelingen Wie is er? Wat doen ze? Wat kunnen ze? Microbiële biomarkers voor ecosysteem functie 4444

Take home messages Hoge diversiteit darm microbiota; > 1000 soorten Microbiota wordt beïnvloed door gastheer (genetische achtergrond); leeftijd, leefomgeving & voeding Verschillen in microbiota diversiteit and samenstelling bij bepaalde aandoeningen – nieuwe aanknopingspunten voor diagnose (& behandeling/preventie) High throughput technologieën, zoals HITChip en functional “meta-omics” zijn onmisbaar om het darm ecosysteem te begrijpen

Together forever in a microbial world We need microbes Microbes need us Microbes need each other