www.thelancet.com Vol 364 September 18, 2004 Culture of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis from the blood of patients with Crohn’s disease Saleh A Naser, George Ghobrial, Claudia Romero, John F Valentine Goede middag Vandaag ga ik vertellen over een artiekel uit the Lancet, dat een associatie beschrijft tussen de ziekte van Crohn en het vinden van levensvatbare mycobacterium paratuberculosis in het bloed. www.thelancet.com Vol 364 September 18, 2004 A. Oleksik, AMC, 26-10-2004

Achtergrondinformatie De etiologie van de ziekte van Crohn blijft onduidelijk CARD15 mutaties in 15-22% van Crohn-gevallen Er bestaat een disscussie over de betekenis van Mycobacterium avium s. paratuberculosis De etiologie van ziekte van Crohn is niet goed begrepen. Er wordt gedacht aan een samenspel tussen genetische, microbiologische en milieu-gebonden factoren. De ziekte van Crohn komt familiair voor. Sinds 2001 is bekend dat mutaties in genen voor CARD15 geassocieerd zijn met de ileocecale betrokkenheid. Dit jaar werd het duidelijk, dat CARD15 de TLR2-pathway remt. De TLR2, een membraangebonden receptor voor peptidoglycaan is verantwoordelijk, via cytokinenproductie, voor de activatie van CD4+ cellen en de differentiatie naar Th1-cell. Th1-infiltraten zijn karakteristiek is voor de ziekte van Crohn. Wat de microbiologische factoren betreft, worden mazelen, mazelen-vaccinatie en diverse mycobacteria aan de kaak gesteld. Mycobacterium paratuberculosis wordt sinds 20 jaar als een mogelijke verwekker gezien, nadat deze bacterie gekweekt werd uit de darm van de Crohn-patienten.

De discussie over de rol van MAP voor het ontstaan en onderhouden van de ziekte van Crohn loopt in somige kringen hoog op. Er zijn meerdere web-sites over dit onderwerp.

MAP is de verwekker van Johne’s disease in de veestapel. Al in 1913 werd de macroscopische en histologische overeenkomst beschreven tussen de Johne’s zieke, de darmtuberculose en de ziekte van Crohn. Op deze dia worden preparaten vergeleken die afkomstig zijn uit een koe met Johne’s disease (boven) en uit een patiënt met ziekte van Crohn (onder). In beide ziekten is er sprake van een discontinue aantasting van de darm. In de aangetaste delen zien wij de verdikking, fibrosering van de wand, stenosering van de lumen en het “cobblestone”-effect van de mucosa met fissuurvormige ulcera. Microscopisch toont de darm vlekkerige lymfoïde ontstekingsinfiltraten, oedeem, fibrose en epitheloid-granulomen.

Macroscopie en Histologie Clustering (Schotland) MAP en Crohn voor tegen Macroscopie en Histologie Clustering (Schotland) MAP PCR in weefsel (2/3 vs ¼) Levensvatbaar MAP in darm, lnn, moedersmelk en bloed Case report: lymphangitis in hals, daarna Crohn Anecdotisch effect van anti-tuberculose-behandeling Expositie (40-60% rund en 7-20% melk) Causaal verband niet aangetoond Cochrane: te kleine getallen De bovengenoemde overeenkomsten worden tot de dag van vandaag gebruikt als een argument voor een causaal verband tussen MAP en de ziekte van Crohn. In deze tabel wordt de heersende discussie samengevat. De ziekte van Crohn komt vaker voor, en op jongere leeftijd, in gebieden waar de MAP-expositie hoog is dan in andere gebieden. Aan de andere kant is de MAP-expositie veel hoger dan de frequentie van de ziekte van Crohn. De ziekte van Crohn komt ook voor in gebieden zonder MAP-expositie. Er is sprake van een associatie tussen de ziekte van Crohn en het vinden van MAP in darm, lymfeklieren, en moedermelk. En toch bestaat er geen zekerheid of deze bevinding niet secundair is aan de beschadiging van de darmmucosa. De anti-tuberculose behandeling zou een gunstig effect hebben op het beloop van de ziekte van Crohn: deze data zijn echter nog te summier om conclusies eraan te verbinden.

52 personen (18-77 j; 50% vrouw): Methoden 52 personen (18-77 j; 50% vrouw): 28 Crohn (60% v) 9 colitis ulcerosa (20%) 4 andere darmpathologie 11 gezonde personen Klinische gegevens: Duur van ziekte Ziekte-activiteit volgens Harvey-Bradshow Gebruik van immunosuppressiva Buffy coat van 4 ml bloed Extractie van DNA (IS900) Kweek MGIT (8-12 wk) -> kleuringen + DNA->nested PCR, BACTEC tot groei-index boven 50 -> idem Terug naar het artikel Het onderzoek werd uitgevoerd in 52 personen, waarvan 28 met de ziekte van Crohn, 9 met ulceratieve colitis en 15 controles. Na verzamelen van klinische gegevens werd er 4ml bloed afgenomen en de buffy coat daarvan werd gebruikt voor het kweken en voor de baseline PCR. Er werd gekweekt in twee systemen. Na afloop werden er diverse kleuringen toegepast en de nested PCR werd verricht. Om de zekerheid te hebben dat er inderdaad sprake was van MAP werd een specifieke IS900 fragment gebruikt voor de nested PCR. De details van de procedures zijn uitvoerig in het artikel beschreven, maar ik laat ze nu buiten beschouwing.

Resultaten Hier worden toegepaste kleuringen gedemonstreerd. Links: immunofluorescentie met IgG tegen MAP Rechts: zuur-vaste staafje (ZN) Er werd ook acridine orange gebruikt.

Op deze dia bevindt zich de samenvating van de PCR-resultaten. Na 12 weken of kweken hadden er 14 patiënten met de ziekte van Crohn een duidelijk positieve PCR voor de IS900, terwijl geen van de controles had dat. Een minderhied van patiënten met colitis ulcerosa had een positieve PCR voor MAP.

Voor diegenen die alles liever zelf willen narekenen worden in het besproken artikel de originele data gepresenteerd. Deze kunt u zien op deze en de volgende dia. PAUZE

PAUZE

Crohn N=28 C.ulcerosa N=9 Controle N=15 Totaal N=52 Vrouw 61% 22% 47% 50% Immuno- suppressiva 62% 44% - DNA Buffy c. 46% (n=13) (n=4) 20% (n=2) 38% Kweek (n=14) (11) (n=2) (1) 0% 16 pat DNA uit kweek (n=10) (n=1) 11 pat (9 strains) In deze tabel zijn de resultaten uit de tekst vertaald. Het blijkt, dat - relatief veel vrouwen de ziekte van Crohn hadden; - en dat er behoorlijk veel immunosuppressie werd gebruikt. MAP PCR in de buffy coat was positief, niet alleen in de IBD-patiënten, maar ook in controles. Na de afloop van het experiment waren alleen in de IBD-patienten de kweken positief voor MAP; dus niet in controles. Bij 50% van de patiënten met de ziekte van Crohn werden de kweken positief voor MAP. Dit in tegenstelling tot patiënten met colitis ulcerosa, van wie de kweken slechts voor 20% positief voor MAP werden. Niet alle positieve kweken werden bevestigd door PCR. Binnen de 11 geisoleerde MAP’s waren er 9 verschillende stammen.

Discussie Bevindingen: Zwakke punten: Sterke punten MAP in bloed = systemische ziekte (Johne’s) MAP en IBD = actieve infectie / colonisatie = gezamelijke triggers? Geen MAP in controles = verschil in eliminatie? PCR+ in controles = expositie Zwakke punten: Geen associatie met immunosuppressie = type 2 error? Echter nooit reactivatie van MAP onder immunosuppressie Sterke punten Bevestigen MAP door IS900 Bewezen van heterogeniciteit van de MAP-stammen Controle voor contaminatie Bij de bespreking van de resultaten sluiten de auteurs aan bij de inleiding. De bevindingen onderstrepen de overeenkomst tussen de ziekte van Crohn en de (systemische) Johne’s disease. Er wordt gespeculeerd over gezameljke triggers voor IBD-beelden. Tegeljkertijd wordt de vraag gesteld hoe het komt dat bij een hoge expositie aan MAP geen MAP wordt gevonden in het bloed van personen zonder IBD. Zouden er inderdaad verschillen zijn in de mogelijkheid tot eliminatie van MAP? Aan het einde worden de sterke punten (zoals gebruik van IS900) en zwakke punten (kleine studie) aangekaart.

Toekomstperspectief (comment by Warwick S Selby) Conclusie Geen bewijs voor een causaal verband Noodzaak voor grotere studies (cohort) Bloedkweken ter bepaling van de behandelingsindicatie? “The Australian randomised, placebo-controlled trial of 2 years’ treatment with clarithromycin, rifabutin, and clofazimine in Crohn’s disease has just been completed. The results are being analysed and are eagerly awaited”. Toekomstperspectief (comment by Warwick S Selby) Concluderend: dit is de volgende studie die geen bewijs vormt voor een causaal verband tussen MAP en de ziekte van Crohn. Maar inmiddels zijn er zo veel aanwijzingen voor een verband of associatie, dat het tijd is voor een grotere studie naar de aard van dit verband. Verder kan er gepostuleerd worden dat bloedkweken hulp kunnen bieden bij het bepalen of een patiënt van een anti-tuberculose-behandeling kan profiteren. Of zo’n behandeling geïndiceerd wordt, zullen we binnenkort horen, namelijk nadat de resultaten van een grote Australische studie gepubliceerd zijn.

Wat zegt de Cochrane-review? A total of seven randomized trials = 355 patients: OR for maintenance of remission = 1.36 (95% CI 0.87-2.13) The two trials reported as abstracts were excluded from subgroup analyses because they did not include any information on adjunct therapy. Two trials (only 89 patients) used anti-tuberculous therapy (clofazimine or clofazimine, rafmpin, ethambutol, and dapsone) in combination with corticosteroids to induce remission. Maintenance therapy consisted of the anti-tuberculous agents without corticosteroids. Control patients received corticosteroids to induce remission but no anti-tuberculous therapy. OR for maintenance of remission of 3.37 (95% CI 1.38-8.24). The number needed to treat was three. The remaining three trials compared the combination of anti-tuberculous therapy and 'standard therapy' with 'standard therapy alone'. The pooled odds ratio was 0.70 (95% CI 0.39-1.25). Met het oog op uw vraag heb ik deze dia voorbereid. Van een totaal van 7 studies zijn er slechts 2 goed uitgevoerd. Deze ziet u hier in geel. Er werd vergeleken tussen … OR was 3.37 en “the number to treat” was 3 Dit waren echter kleine studies. Daarom was de eindconclusie voorzichtig: er moeten meer studies plaatsvinden.

Hoe zit het met CARD15 – TLR2? Intracellular receptor Reageert op peptidoglycan “muranyl peptide” = MDP Stimuleert NFκB = inflammatie Maar remt TRL 2 TLR 2 Transmembrane receptor Activatie in phagosom Reageert op peptidoglycanen (G+ bacterieen) Stimuleert phagocytose en fusie van phagosom met lysosom Is dus noodzakelijk voor CD4+ activatie en selectie (Th1, Th2) B7-CD28 Ag/HLA II - TCR Mycobacterium Ontwijkt de fusie van phagosom met lysosom Voorlopig weten we dat:….