Epigenetisch epidemiologisch onderzoek Rudolf Talens PHD epigenetische epidemiologie Dept. Molecular Epidemiology Leiden University Medical Center

Opbouw presentatie Epigenetica wat is het Epigenetisch onderzoek Epigenetica in epidemiologisch onderzoek Epigenetica in de klas

Wat is Epigenetica Wat denken jullie?

Biochemische benadering 2 m chromosoom in celkern < 10 µm Opvouwen (CONDENSATIE!) Ruggengraat = PO3-  Neutraliseren Wikkelen rondom histon eiwitten Histonen + DNA = nucleosoom Kleine chemische groepen aan Histon staarten Attractie, hogere condensatie  gesloten chromatine Repulsie, minder condensatie  open chromatine Condensatie beperkt toegankelijkheid transcriptie Het hele genoom niet gelijkmatig gecondenseerd http://www.youtube.com/watch?feature=player_detailpage&v=gbSIBhFwQ4s

Fysiologische benadering Ons lichaam bestaat uit vele cel typen Functioneel en morfologisch heel anders Allemaal uit één zygote  zelfde genoom Niet-genetische Informatie voor cel identiteit Epi = op!  boven-genetische informatie Embryogenese en differentiatie kennen enorme epigenetische veranderingen (Reik, 2007)

Biologische benadering Niet elk gen / allel komt tot expressie Gen expressie verschillen tussen isogene individuen Bv 1e gekloonde kat (cc, DNA donor: rainbow) Beide lapjeskatten, let op vacht! X-chromosoom inactivatie In vroege ontwikkeling één allel uitgezet Willekeurige beslissing wordt correct doorgegeven Zorgt voor mozaïek (lapjes patroon vacht) Gekloonde Lapjeskatten ander vacht patroon

Wat is epigenetica? Biochemische informatie op en rondom het DNA dat plaatselijk de mate van condensatie van het chromosoom bepaalt Onafhankelijk van de genetische code Programmeerbaar gedurende ontwikkeling en cel differentiatie Mitotisch overerfbaar Stabiel in gedifferentieerde cel Verandering blijft mogelijk Aanpassing gen expressie aan omgeving

Definitie Mitotisch overerfbare verschillen in gen expressie potentiaal die niet worden veroorzaakt door verschillen in de genetische code (Jaenisch & Bird, 2003)

Epigenetische informatie Verschillende gecorreleerde lagen / vormen

Epigenetische regulatie gen expressie Transcriptionally silent DNA Transcriptionally active DNA Transcription Activator complex Exon 1 Exon 2 Methylated Lys4 on H3 Acetylated H3 M --CG-- --GC-- HDAC MBP DNMT Lys9 on H3 miRNA https://www.youtube.com/watch?v=29doT6Hf2MI&feature=player_detailpage

Epigenetische mechanismen Vergelijk genetische code met computer code Dan is epigenetische code besturingssysteem Epigenoom is dynamisch (i.t.t. genoom) Omgeving heeft invloed Geïnduceerd fysiologisch proces (bv wondgenezing) Gericht  aanpassing aan omgeving (bv eetgedrag) Willekeurig  schade (bv toxische blootstelling) Willekeurige veranderingen zonder omgevingsinvloed Incorrect epigenetisch onderhoud

Gen  Omgeving  Ziekte Gen  Ziekte Gen  Omgeving + Kans  Ziekte Gen  Omgeving  Ziekte

Concepten rondom epigenetica Welke concepten zijn er nu voorbij gekomen? Welke had je al bedacht? Welke zijn er nieuw?

Epigenetisch onderzoek Meten epigenetische informatie DNA methylatie (CpG sites) meest onderzochte laag van epigenetische informatie Methyl gevoelige restrictie enzymen Methylated DNA immuno precipitation Bisulfiet (BS) behandeling Histon modificaties Technisch steeds meer mogelijk CHIP: chromatine immuno precipitation (sequencing) Verouderd Meest gebruikt

Meten DNA methylatie (BS) Bisulfiet creëert artificiële SNP Ongemethyleerde C wordt U (T) gemethyleerde C blijft C Detecteren met gangbare sequencing technieken DNA methylatie: 1 molecuul: binair (wel of niet) 1000 moleculen: (0 % – 100 %) 2 allelen / cel, meten 500 cellen Kwantitatieve variabele Inter-individuele variatie BS PCR Talens et al., Faseb J. 2010

Meten DNA methylatie Epigenetisch onderzoek complexer dan genetisch 1 lichaam, 1 genoom, geen weefsel verschillen 1 leven, 1 genoom, zelfde genen van geboorte tot dood Elke Levensstijl, 1 genoom, wat je doet beïnvloed genen niet Elke ziekte, 1 genoom, ziekte veranderd je genen niet (causatie) Sequentie humaan genoom bekend UCSC genome browser

Epigenetisch onderzoek Humaan epigenetisch onderzoek lastig Veel genetische variatie Beperkt aantal weefsel beschikbaar voor onderzoek Geen controle over levensstijl / leef omgeving Dier modellen Inteelt populatie, geen genetische variatie Controle over omgeving Elk weefsel op elk moment toegankelijk

Dier modellen: de Agouti muis Normale expressie agouti gen Kort in haar follicel voor gele gloed op zwart haar Toevallige transposon insertie creëerde alternatieve promoter in niet coderend deel Expressie Avy via ps1A promoter mogelijk in elke cel Afhankelijk van ps1A DNA methylatie

Dier modellen: de Agouti muis Inteelt model voor epigenetische regulatie Isogene individuen DNA methylatie  fenotypisch verschil Vachtkleur en obesitas = observeerbaar fenotype Fenotypisch spectrum gecorreleerd aan epigenetica Waterland & Jirtle MCB 2003; Dolinoy et al. EHP 2006 methylated unmethylated

Dier modellen: de Agouti muis DNA methylatie ps1A promoter prenataal beïnvloedbaar (folium) Verschuiving vachtkleur nest Eiwit deficiëntie ook Hersteld met folium Waterland & Jirtle MCB 2003 Dolinoy et al. EHP 2006

Andere diermodellen Schapen folium arm dieet in pre implantatie fase: blastulas van controle en dieet moeders werden op overgebracht en geïmplanteerd in baarmoeder van normaal gevoede schapen (Sinclair PNAS 2007) Folium arm dieet geassocieerd met Genoom wijde epigenetische verschillen in foetus Vettere mannetjes (22 mnd.) met minder spier massa Slechtere insuline respons Ratten Prenatale calorische restrictie tegengesteld effect van prenatale eiwit restrictie op zelfde genen (PPARα en GR)

Epigenetica en stress? Rat model kinderverwaarlozing Minder moederzorg  hogere stress respons Hogere DNA methylatie Glucocorticoid receptor Gekruiste opvoeding zelfde effect Terugdraaien met inhibitie histon deacetylase Zelfde mechanisme in muizen a.g.v. stress vroeg in leven Methylatie gen arginine vasopressin Ook in mensen a.g.v. kindermishandeling Hersenen van zelfmoord slachtoffers Weaver et al. Nat Neurosci 2004. Murgatroyd et al. Nat neurosci 2009 McGowan et al. Nat neurosci 2009

celkweek DNA methylatie verandert willekeurig 2 Cellijnen in kweek Zelfde originele cel Zelfde omstandigheden 100 + passages Landan et al. Nat Genet 2012

Humaan epigenetisch onderzoek Humane interne weefsels na operatie of autopsie Populatie studies  epidemiologie Historische gebeurtenis (b.v Hongerwinter) Familie studies (bv Tweelingen) Klinische cohorten (bv hartinfarct Meestal slechts 1 bloedmonster / deelnemer beschikbaar! Voorwaarden epigenetische epidemiologie Wat je meet is niet / weinig veranderd met de tijd Wordt niet beïnvloed door de uitkomst (bv ziekte) Is wat je kunt meten gerelateerd aan de ziekte WEEFSEL VERSCHILLEN!

Voorwaarden voor epidemiologie Wat zegt DNA methylatie in bloed nou? 8 kandidaat loci voor CHD getest Stabiliteit over 10 – 20 jaar 2 weefsels (bloed en wangslijmvlies) Locus Correlation IGF2R 0.88 LEP 0.90 CRH 0.94 IGF2 0.92 APOC1 0.96 Locus Correlation IGF2R 0.83 LEP 0.80 CRH 0.91 APOC1 0.82 Talens et al., Faseb J. 2010

Autopsie studies Overeenkomsten tussen bloed en interne weefsels? Genoom wijde patronen, weefsels verschillen Per CpG site, 30 % correlatie > 0.75 bloed en één intern weefsel Talens et al., UNPUBLISHED

Hypothese Developmental Origins of Health and Disease Epidemiologische studies: Associatie CHD risico en slechte condities rondom geboorte Klein bij geboorte Historical events (e.g. famine) Dierstudies impliceren epigenetische mechanismen Gametogenesis Conception Growth Birth Ageing Adulthood Adverse conditions Coronary Heart Disease DOHaD

De Hongerwinter Familie Studie Eind WW2, voedsel embargo west Nederland Verschrikkelijke episode, maar overeenkomsten met interventie studie diermodellen Individuen blootgesteld rondom geboorte getraceerd en Food ration kCal/day Famine period Lumey et al., Int J Epidemiol 2007

Epigenetica gevoelig voor hongerwinter Prenataal blootgesteld vs zus of broer (zelfe sexe) 7 / 16 loci verschilden Associaties waren sexe en timing specifiek Meer aan de hand dan folium deficientie 2x10-6 2x10-5 3x10-3 8x10-4 8x10-3 3x10-6 6x10-5 Gene Early Late Gender IGF2 GNAS F INSIGF M IL10 LEP ABCA1 Tobi et al. Hum Mol Genet 2009

Gevoeligheid rondom conceptie Van gametogenese tot aan embryogenese Epigenetische herstructureringen Beslissingen over cel identiteit

Epigenetica gedurende levensspanne Nederlandse eeneiige tweelingparen (NTR) 66 MZ twin pairs (< 30 years) Deense eeneiige tweelingparen (DTR) 67 MZ twin pairs (> 73 years) Adult lifespan 18 88 NTR DTR 50 Talens et al., Aging cell 2012

Ouderen hogere epigenetische variatie * P < 0.05 *** *** *** *** *** *** *** *** Mean Methylation ** P < 0.01 *** P < 0.001 *** ** St Dev Talens et al., Aging cell 2012

Epigenetische variatie binnen MZ paar Epigenetische tussen individuen en binnen tweeling paren hoger op oude leeftijd ** *** *** *** ** *** *** *** ** Talens et al., Aging cell 2012

Epigenetica gedurende levensspanne 18 50 88 Adult lifespan NTR DTR NTR Biobank project (NTR) 66 MZ twin pairs (< 30 years) LSADT study (DTR) 67 MZ twin pairs (> 73 years) 61 NTR MZ twin pairs (30 - 65 years) 25 NTR MZ twin pairs (> 65 years) NTR 219 MZ twin pairs 6 assays: global (LINE1) en 5 specifieke loci 2 weinig toename in variatie: KCNQ1OT1 and GNASAS 3 grote toename in variatie: IGF2DMR, LEP and CRH Talens et al., Aging cell 2012

Epigenetica gedurende levensspanne Epigenetische variatie lijkt geleidelijk toe te nemen *** ** * Talens et al., Aging cell 2012

Longitudinale follow-up op hoge leeftijd 19 DTR MZ twin pairs 73 – 81 years old at first sampling Blood samples from 1997 and 2007 18 50 88 Adult lifespan NTR DTR NTR NTR DTR DTR 1997 2007 Talens et al., Aging cell 2012

Epigenetische variatie na 10 jaar follow-up Toename in epigenetische variatie blijft tot op hoge leeftijd geleidelijk doorgaan * Talens et al., Aging cell 2012

Epigenetica en CHD Honger winter studie Prenatale blootstelling verhoogd risico op Hart en vaat ziekten Metabole ziekten Schizofrenie Epigenetische veranderingen  CHD? Gametogenesis Conception Growth Birth Ageing Adulthood Adverse conditions Coronary Heart Disease DOHaD

Epigenetica en CHD Klinische studie op hartinfarct 124 cases vs 126 controls, Geen eerdere CHD icidenten Verhoogd risico door bloedwaarden, BMI, roken Hartinfarct (MI) gedurende 3 jaar follow up 6 Loci, prenataal gevoelig voor hongerwinter Gametogenesis Conception Growth Birth Ageing Adulthood Adverse conditions Coronary Heart Disease DOHaD Talens et al., Int J Epidemiol 2012

Associatie epigenetica en MI Sex specifieke associatie DNA methylatie insuline en G-receptor-α-anti-sense Associatie onafhankelijk van CHD risico factoren Associatie over alle CpG sites binnen locus 0.001 + 0.60 + 4.2 (1.28) 48,4 (7.0) ♀ 0.850 + 0.03 + 0.2 (1.12) 49.3 (6.6) ♂ GNASAS 0.002 + 0.59 + 2.5 (0.76) 75.5 (4.2) 0.659 − 0.07 − 0.4 (0.87) 76.0 (5.1) INS Standardized % meth p-value Cases – Controls (SE) Mean (SD) % methylation Sex Locus Controls *, p < 0.05 **, p < 0.01 ***, p < 0.001 Talens et al., Int J Epidemiol 2012

Epigenetische epidemiologie Epigenetische mechanisme geven een geloofwaardig moleculair mechanisme waarmee de associatie tussen ouderdomsziekten en vroege (prenatale) omgeving, en levensstijl. Wetenschappelijk bewijs neemt toe! Gametogenesis Conception Growth Birth Ageing Adulthood

Many thanks LUMC, dpt. Cardiology, The PROSPER Group Prof. Dr. W. Jukema and Dr. S Trompet LUMC, dpt. Medical statistics and bioinformatics Prof. Dr. Hein Putter, Dr. J. Goeman LUMC, dpt. Molecular epidemiology Dr. B. Heijmans, Prof. Dr. E. Slagboom, Dr. S Bos, Dr. I. Meulenbelt, Drs. E v.d. Akker, Dr(s). E. Tobi, Drs. M Drijfhout v Hooff, Drs. H. Suchiman, D. Kremer, R. v.d. Breggen N. Lakenberg and W. de Dijcker LUMC, dpt. Pathology Dr. J Bovee, R. Guijt, T. Alberts, E. Dreef Nederlands Tweeling Register (Prof. Dr. D Boomsma, Dr. A Willemsen) Danish Twin Registry (Prof. Dr. K Christensen, Prof. Dr. L. Christiansen)

Epigenetica in de klas Zoeken naar Nog een vraag Aansprekende en illustratieve voorbeelden Projecten, experimenten en excursies Nog een vraag Prenatale adaptatie ….. Wat of wie denken we dan aan?

Doorgeven van verkregen eigenschappen Evolutie Populatie Vele generaties Genetische code Adaptatie Individu Enkele generaties Epigenetische code? Plaatje vrouw / generaties Jean-Baptiste Lamarck (1744-1829)