Susceptibiliteitsbepaling van planktonische en sessiele Burkholderia cepacia complex cellen Katrien De Visschere

Inleiding Burkholderia cepacia complex: 17 nauw verwante species Gram-negatieve bacteriën Kunnen ernstige infecties veroorzaken bij mucoviscidosepatiënten Behandeling moeilijk door grote resistentie ≠ stammen vormen goed biofilms → verhoogde resistentie

Inleiding Mucoviscidose Autosomaal recessieve aandoening Ongeneeslijk Secreties van kliercellen zijn minder vloeibaar → o.a. problemen met luchtwegen en spijsvertering Infectie met B. cepacia complex bacteriën: → “cepacia syndroom”: dodelijk → geleidelijk achteruitgang in longfunctie

Inleiding Biofilms Microbiële gemeenschap van sessiele cellen Vastgehecht op een substraat, een oppervlak of aan elkaar Ingebed in een extracellulaire matrix Sessiele cellen vertonen in het algemeen een grotere resistentie tegen antimicrobiële agentia dan planktonische cellen

Onderzoek Wat? Gevoeligheid van planktonische cellen en sessiele cellen (biofilms) van 33 ≠ Burkholderia cepacia complex stammen t.o.v. 6 ≠ antibiotica bepalen → ceftazidime, ciprofloxacine, meropenem, minocycline, tobramycine, trimethoprim-sulfamethoxazole (1-19) Experimenten op “jonge” en “oude” culturen Planktonische cellen “Jonge” culturen: minimaal inhiberende concentratie (MIC) “Oude” culturen: afdoding stationaire fase cultuur Sessiele cellen “Jonge” culturen: minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC) “Oude” culturen: afdoding mature biofilm

Onderzoek Waarom? Vergelijken groei-inhibitie bij “jonge” planktonische cellen en biofilms door antibiotica Vergelijken afdoding van planktonische cellen in de stationaire fase en mature biofilms door antibiotica

Methoden “Jonge” planktonische cellen: Verse reincultuur → kiemsuspensie (OD: 0,05) in MH 1x → 50x verdunnen Kuipjes van antibiotica-microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: plat) vullen met MH 1x en verdunde kiemsuspensie 20u incubatie (37°C) Absorptie in elk kuipje meten met VICTOR2TM Bepaling minimaal inhiberende concentratie (MIC) Kuipjes zonder groei → 100µL uitplaten (strijkplaatmethode) Na 48u incubatie (37°C): groei nagaan Bepaling minimaal bactericide concentratie (MBC)

Methoden “Jonge” biofilms: Verse reincultuur → startsuspensie in MH 1x Nacht incubatie in warmwaterbad (37°C) Startsuspensie → werksuspensie (OD: 0,05) Kuipjes van microtiterplaat (96 kuipjes, bodem: rond) vullen met MH 1x en werksuspensie (100µL) 4u incubatie (37°C) 3x spoelen met fysiologisch water Kuipjes vullen met 100µL MH 2x Antibiotica toevoegen (100µL)

Methoden “Jonge” biofilms: 20u incubatie (37°C) Spoelen met fysiologisch water CellTiterBlue toevoegen (detectie levende cellen) 1u incubatie (37°C) Fluorescentie meten met VICTOR2TM Bepalen minimaal biofilm inhiberende concentratie (MBIC)

Methoden Mature biofilms: Verse reincultuur → kiemsuspensie in MH 1x Nacht incubatie in warmwaterbad (37°C) Kiemsuspensie → startsuspensie (OD: 0,05) Siliconeschijfjes in microtiterplaat (24 kuipjes) brengen Kuipjes vullen met MH 1x en startsuspensie 4u incubatie (37°C) 3x spoelen met fysiologisch water Kuipjes vullen met MH 1x 20u incubatie (37°C)

Methoden Mature biofilms: Overbrengen in antibiotica-microtiterplaat →concentraties antibiotica: 10 x MIC, tobramycine: 4 x MIC 20u incubatie (37°C) 3 x wassen met fysiologisch water Schijfjes overbrengen in falconbuisjes Buisjes 3 x vortexen en soniceren (cellen losmaken) Kiemsuspensie wordt 7 maal 1:10 verdund 1mL per verdunning uitplaten (plaatgietmethode) Kolonies tellen na 48u incubatie Bepalen reducties in log(KVE)/schijfje

Resultaten: MIC MIC vs. de klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatiënten (KHCS)   MIC ≤ KHCS MIC > KHCS ceftazidime 63,7% 36,4% ciprofloxacine 50,0% meropenem 63,6% minocycline 87,9% 12,1% tobramycine 92,4% 7,6% TMP-SMX (1-19) 21,2 78,8%

Resultaten: MBC Hoe verhoudt de MBC zich tot de MIC? Grote spreiding MBC t.o.v. MIC → uitzondering: tobramycine (kleine spreiding)   mediaan spreiding ceftazidime 4 1 - 64 ciprofloxacine 2 1 - 32 meropenem 2 - 4 minocycline 32 1 - 512 tobramycine 1 - 4 TMP-SMX (1-19) 8

MBIC vergeleken met MIC Relatie MBIC vs. MIC: De MBICs zijn vergelijkbaar met de MICs voor het grootste deel van de stammen   MBIC < 1/2 x MIC 1/2 x MIC  MBIC  2 x MIC MBIC > 2 x MIC ceftazidime 21,2% 75,8% 3,0% ciprofloxacine 0,0% 84,8% 15,2% meropenem 9,1% 78,8% 12,1% minocycline 1,5% 77,3% tobramycine 6,1% 80,3% 13,6% TMP-SMX (1-19) 71,2% 29,7%

Reductie in aantal cellen bij mature biofilms De onderzochte antibiotica veroorzaken bij alle stammen reductie Mate van reductie: vertoont een grote variatie Tobramycine is het meest werkzame antibioticum → met een paar uitzonderingen Mate van biofilmvorming ↑, cellen die overblijven na behandeling met antibiotica↑ B. multivorans LMG 13010 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 groeicontrole ceftazidime ciprofloxacine meropenem minocycline tobramycine TMP-SMX aantal cellen (log(KVE)/schijfje) B. pyrrocinia LMG 14191 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 9,0 groeicontrole ceftazidime ciprofloxacine meropenem minocycline tobramycine TMP-SMX aantal cellen (log(KVE)/schijfje)

Conclusie “Jonge culturen” MIC: vergelijking met klinisch haalbare antibioticaconcentratie in het sputum van mucoviscidosepatiënten:  voor veel antibiotica is deze concentratie onvoldoende om groei-inhibitie te veroorzaken MBC: variabel t.o.v. MIC (uitzondering: tobramycine) MBIC: vergelijkbaar met MIC  bijna alle MBICs liggen binnen de range [1/2 – 2] x MIC

Conclusie “Oude” culturen Reductie in aantal cellen bij mature biofilms: → vertoont een grote variatie → tobramycine is het meest werkzame antibioticum → mate van biofilmvorming ↑, cellen die overblijven na behandeling met antibiotica↑

Toekomstperspectieven Experimenten op planktonische cellen in een stationaire fasecultuur moeten nog uitgevoerd worden: Antibioticaconcentraties: 10 x MIC, behalve tobramycine: 4 x MIC

Met dank aan: Prof. Nelis en Prof. Coenye Apr. E. Peeters Apr. B. Quartier

Zijn er nog vragen?