Laboratorium diagnostiek van cystine dr. Leo A. J. Kluijtmans Lab Laboratorium diagnostiek van cystine dr. Leo A.J. Kluijtmans Lab. Genetische, Endocrine en Metabole Ziekten UMC St Radboud

Inhoud presentatie Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten (Klein beetje) biochemie Opwerken buis bloed / isolatie granulocyten Meting cystine (eigenlijk: cysteine) Hoe kunnen we elkaar vinden Vragen

Lab Genetische Endocriene en Metabole Ziekten Gespecialiseerd laboratorium op het terrein van de erfelijke stofwisselingsziekten (metabole ziekten) Ca. 170 fte, waarvan de ~50% in de diagnostiek 8 stafleden, waarvan 2 in de metabolieten diagnostiek (lichaamsvloeistoffen) Ca. 2000 nieuwe patiënten / jaar

Het UMC St Radboud, Nijmegen

LGEM laboratorium

LGEM laboratorium

De humane cel Lysosoom Celmembraan Mitochondrion Endoplasmatisch reticulum Cytoplasma Kernmembraan Kernporie Kern Kernlichaampje Ribosoom Golgi-systeem.

Het lysosoom Ontdekt in 1949 door Christian de Duve De stofzuigers van de cel Afbraak van allerlei celcomponenten (vetten, eiwitten, complexe suikers, erfelijk materiaal) Afbraakproducten gaan naar cel plasma Zuur milieu (zuurtegraad (pH): ~5); cel: ~7.2

De belangrijkste spelers Cysteine: HOOC HC-CH2-SH ( ) NH2 Cystine: HOOC COOH HC-CH2-S-S-CH2-CH ( ) NH2 NH2 Cysteamine: NH2-CH2-CH2-SH ( ) COOH Cysteamine-cysteine disulfide: NH2-CH2-CH2-S-S-CH2-CH ( )

Cysteine-transporter Hoe gaat het ‘normaal’? cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysosoom Lysine-transporter De cel

Wat gebeurt er bij Cystinosis cystine cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysine-transporter Lysosoom De cel

Wat gebeurt er bij Cystinosis cystine Cystine-transporter Cysteine-transporter Lysine-transporter Lysosoom De cel

Werking van cysteamine Cystìne-transporter cysteamine Cysteine-transporter cysteine Lysine-transporter Lysosoom De cel

Diagnose cystinosis Cystine stapelt in lysosoom tgv het transporter defect Cystine is (fors) verhoogd in m.n. de granulocyt (= witte bloedcel waarin veel lysosomen zitten) Cystine is ook verhoogd in gekweekte huidfibroblasten DNA diagnostiek van het Cystinosine gen (17p13)

Wat zijn de ‘challenges’ Isolatie granulocyten uit bloed Vermijden contaminatie met andere bloedcellen (mn rode) Vermijden artificiële vorming van cystine uit cysteine Oxidatie van cysteine geeft cystine Rode- en witte bloedcellen bevatten veel cysteine

(polymorphonucleaire cellen) Granulocyt isolatie (polymorphonucleaire cellen)

Leukocyt isolatie, procedure Met behulp van dextraan (complex suiker molecuul) worden de bloedcellen gescheiden Aan buis bloed wordt dextraan toegevoegd, incubatie 1 uur op ijs.

Dextraan incubatie, 1 uur op ijs Leukocyten (witte cellen) Erythrocyten (rode cellen)

Het leukocyten isolaat Neutrofiele granulo Eosinofiele granulo Basofiele granulo Lymfocyt Monocyt 35-75% 0-5% 0-2% 15-40% 0-6% Totaal: 4.4-11.0 x 109 per liter granulocyten

Dextraan incubatie Leukocyten (witte cellen) Erythrocyten (rode cellen)

Granulocyt isolatie uit leukocyt suspensie Het leukocyten isolaat wordt behandeld met Ficoll (= complexe suiker). Ficoll wordt onder leukocyt suspensie gepipetteerd (géén menging lagen) Centrifugatie, 20 min, 4°C, 500g (1800 rpm) Scheiding op soortelijk gewicht

De Centrifuge

De Ficoll gradient lymfocyten granulocyten Echter nog wel mét rode bloedcellen erbij

Contaminatie met rode bloedcel Rode bloedcellen nemen makkelijk water op uit hun omgeving Plaats rode bloedcellen in een “waterige omgeving” en ze zullen opzwellen en barsten + 3 mL ijskoude MilliQ (= zuiver labwater)

Wassen en opslag geïsoleerde granulocyten De geïsoleerde granulocyten worden 3 x gewassen met fysiologisch zout (PBS). Tussendoor: centrifugeren 10 min, 4°C, 500g Afzuigen wasbuffer en invriezen in vloeibare stikstof (-196°C) Opslag in -80°C vriezer tot analyse

Meting cystine uit de granulocyt met HPLC

Andere –SH verbindingen Wat is de situatie ? HOOC HC-CH2-SH NH2 De cel Lysosoom cysteine Andere –SH verbindingen cystine

Cellen kapot maken

Als we cellen kapot maken, komt er zuurstof bij… Door “oxidatie” krijgen we foutief verhoogd cystine uit 2 moleculen cysteine Vals verhoogd cystine

De oplossing… N-ethylmaleimide (NEM) Het NEM reageert met –SH verbindingen (o.a cysteine)

Als we cellen kapot maken, in aanwezigheid van NEM ( ) in overmaat Het NEM bindt aan alle –SH groepen en vangt daarmee ook het aanwezige cysteine weg Het bindt NIET aan cystine

Complex mengsel van verbindingen Cystine ( ) is moeilijk te meten. Cysteine ( ) is makkelijk te meten!

Complex mengsel van verbindingen

Het complexe mengsel In het isolaat zit nog cystine (moeilijk meetbaar) en verder het cysteine-NEM en andere SH-NEM stoffen. De overmaat aan NEM is weggevangen en kan géén cysteine meer binden Na wegvangen overmaat NEM kunnen we cystine “breken” tot 2 x cysteine en dit meten. Er wordt een ‘kleurstof’ specifiek voor cysteine toegevoegd

Complex mengsel van verbindingen Gekleurd cysteine te meten met fluorescentiedetector

Cysteine meting met HPLC HPLC: High Performance Liquid Chromatography (hogedruk vloeistof chromatografie) Chromatografie: het scheiden van een mengsel van stoffen op basis van hun eigenschappen

Hoe werkt HPLC?

De ‘cystine’ HPLC in het lab.

De HPLC kolom waarop de stoffen gescheiden worden

De vloeistoffen

De monster verwisselaar van de HPLC

Cysteine kwantificeren Om de hoeveelheid te kunnen bepalen wordt een zogenaamde ijklijn opgenomen. Bekende concentraties cysteine worden geanalyseerd en piekoppervlakten worden gemeten

Chromatogram Diverse bekende (!) concentraties cysteine in tweevoud bepaald op de HPLC. Computer berekent het piekoppervlak.

Van piekoppervlak naar concentratie Oppervlakte piek Hoeveelheid cysteine In patiëntenmonsters wordt het piekoppervlak van de cysteine piek bepaald en met behulp van de ijklijn wordt cysteine concentratie bepaald. Stel: piekopp is 150000; dan is de bijbehorende cysteine concentratie: 14.20 µM

Van cysteine concentratie naar uitslag Oppervlak ~ Concentratie cysteine Cysteine is afkomstig van cystine (= ½ cystine) Cysteine concentratie wordt gehalveerd. Hoeveelheid eiwit (in mg) is een maat voor de hoeveelheid geïsoleerde cellen. Uitslag is xx nmol cystine / mg eiwit.

Referentiewaarden / Targetwaarden In gezonde personen: < 0.17 nmol/mg (in granulo’s) Targetwaarde: lager dan de range zoals gezien wordt bij “obligaat dragers” (dwz ouders van patiënten) Cystinosis is een autosomaal recessief ziektebeeld: Ouders zijn drager maar hebben géén klachten.

Wat bieden we aan in 2011? Kinderpoli: 11-01-2011 Volwassenen: 17-01-2011 Kinderpoli: 25-01-2011 Meetweek Nijmegen: week 4 (ma 24-01) Kinderpoli: 12-04-2011 Volwassenen: 18-04-2011 Kinderpoli: 26-04-2011 Meetweek Nijmegen: week 17 (ma 25-04)   Kinderpoli: 14-06-2011 Kinderpoli: 21-06-2010 Volwassenen: 27-06-2011 Meetweek Nijmegen: week 26 (ma 27-06) Volwassenen: 26-09-2011 Kinderpoli: 11-10-2011 Kinderpoli: 25-10-2011 Meetweek Nijmegen: week 43 (ma 24-10)

Isolatie granulocyten in Nijmegen In de 3 weken voorafgaand aan de Nijmeegse meetweek kunnen op maandag én woensdag bloedmonsters worden ingestuurd naar Nijmegen voor granulocyt isolatie in Nijmegen. Samples dienen te worden aangekondigd en moeten voor 12 uur in het lab zijn (ivm langdurige opwerking) Monsters worden dan in de eerstvolgende meetsessie meegenomen.

Ter afsluiting Veel stappen in de opwerking van de bloedmonsters tot een uitslag in nmol cystine/mg eiwit Complexe diagnostiek met veel ‘pitfalls’ Graag bereid met u van gedachte te wisselen hoe we de dienstverlening nog beter kunnen afstemmen op uw wensen.

Acknowledgments Analisten: Dinny van Oppenraaij-Emmerzaal Jenneke Keizer-Garritsen Gwendolyn Beckmann Louk Geelen “Het Oude Team” Addy de Graaf-Hess Henk Blom Elena Levtchenko Marjolein Bos

Ter afsluiting nog een mooi plaatje…

ERNDIM, kwaliteitsrondzendingen European Research Network Inherited Disorders of Metabolism