Immunoprecipitatie Immuno geeft aan dat je antilichamen gebruikt Wat is een antilichaam? Eiwit dat in een dier wordt geproduceerd als reactie op antigeen (een lichaamsvreemde stof, bv. een eiwit) Variabele deel bindt specifiek aan antigeen (Fab domein) Constante gedeelte (Fc domein)

Hoe wordt een antilichaam gemaakt? Dier (konijn, muis, kip) produceert antilichamen als reactie op inbrengen antigeen Antilichaam materiaal verzamelen (bloed, eieren) - bevat antilichamen tegen veel verschillende antigenen!!! Zuiveren antilichamen uit dit materiaal (slechts een bepaald percentage van de antilichamen bindt aan specifiek antigeen)

Immunoprecipitatie Techniek om eiwitcomplexen te identificeren - hierdoor wordt duidelijker welke functie deze eiwitten hebben Eiwit 2 Eiwit 1 GFP Eiwit 3 anti-GFP Een antilichaam herkent een van de eiwitten - vaak wordt een fusie eiwit gemaakt, bijv. met GFP

Voorbeeld immunoprecipitatie (uit onderzoeksgroep van Dolf Weijers) Lokalisatie eiwit1-GFP in vaatweefsel plantenwortel Eiwit 1 GFP Eiwit 2 wild-type wortel zonder eiwit 1 (mutant) eiwit 2 abnormaal vaatweefsel Eiwitcomplex geeft informatie over de functie van het eiwit

Hoe voer je een immunoprecipitatie uit? weefsel met eiwit-GFP malen anti-GFP toevoegen aan cel extract Eiwit 1 GFP Eiwit 2

Binden aan Protein A agarose Eiwit 1 GFP Eiwit 2 agarose bolletje Protein A

Precipitatie eiwitcomplex door centrifugeren vloeistof afpipetteren bolletjes wassen

Hoe voer je een immunoprecipitatie uit? Eiwitcomplex denatureren en op gel laden Eiwitbandjes scheiden door electroforese, kleuren en uitsnijden SDS-polyacrylamide gelelectroforese

Proteomics: identificatie van de eiwitten Voorbehandeling met iodoacetaat om de vrije SH groepen (cysteines) van de eiwitten te blokkeren door carboxymethylering

Proteolyse Eiwit in stukjes knippen met trypsine tot korte peptides

Voorbehandeling geëxtraheerde peptiden De geëxtraheerde peptiden worden ontzout en gemengd met matrix oplossing. Dit mengsel wordt op een plaatje gebracht en verdampt zodat er kristallen van het matrixmateriaal en peptiden overblijven. Na bestraling door een laser en ionisatie (MALDI) worden de peptiden geanalyseerd met TOF mass spectrometrie.

MALDI-TOF spectrometer

Identificatie van eiwitcomplex De massa van een polypeptide keten kan bepaald worden met de MALDI-TOF techniek. Matrix Assisted Laser Desorption Ionization-Time Of Flight

Massaspectrum tryptisch digest Massa en lading van elk peptide worden geregistreerd Identificatie van de eiwitten

Voorwaarden voor succesvolle IP Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP Eiwit 1 GFP Eiwit 2

Uitvoering experiment Testen van kwaliteit antilichaampreparaat Meer dan 1% van de IgG moleculen moet reageren met GFP Immunoprecipitatie en isolatie peptides Identificatie peptide(s) en Toekenning eiwitcomplex