CRISPR/Cas begrijpen met modellen en simulaties Caspar geraedts

https://www.youtube.com/watch?v=A5rUC6NiQfo Zeggen: Eerst wat, dan hoe. Te veel materiaal om allemaal helemaal te doen: maar genoeg om idee te krijgen hoe je dat in de klas zelf kan doen. Veel filmpjes over CRISPR/Cas, maar… wel helder over wat je er mee kan, maar niet hoe het werkt. Bekend met stempelset? 2

PROGRAMMA wat? hoe? CRISPR/Cas9 CRISPR/Cas9 in E.coli informeren… genome editing met CRISPR/Cas9 gene drive met CRISPR/Cas9 hoe? informeren… en uitbeelden (begrijpen met je handen) Zeggen: Eerst wat, dan hoe. Te veel materiaal om allemaal helemaal te doen: maar genoeg om idee te krijgen hoe je dat in de klas zelf kan doen. Veel filmpjes over CRISPR/Cas, maar… wel helder over wat je er mee kan, maar niet hoe het werkt. Bekend met stempelset? 3

Cas9 Cas9 kan… heel precies knippen waar je maar wil... … door de combinatie van nuclease en gRNA. Cas9 is bijzonder eiwit. Andere nucleasen / knip-eiwitten: binden op basis van vorm eiwit/eigenschappen aminozuren. Cas9 maakt gebruik van basenparing. 4

Cas9 Cas-RNA-complex dsDNA: dubbelstrengs DNA gRNA (guide RNA): gesynthetiseerd RNA voor genome editing met Cas9 5

Cas9 Cas-RNA-complex crRNA (crispr RNA): RNA-transcript uit CRISPR-regio van plasmide bacterie; de eerste 20 nt aan het ‘5-eind vormen de spacer (complementair met specifiek virus), de rest is afkomstig van repeat (altijd hetzelfde, onafhankelijk welk virus) tracrRNA: RNA-transcript (ook weer altijd hetzelfde, onafhankelijk welk virus) dat nodig is voor binding van RNA aan Cas-eiwit; strict genomen wordt dit tracer RNA gecodeerd door stukje DNA net buiten CRISPR-region [in deze workshop maken we dit onderscheid niet en spreken we gemakshalve over spacer RNA en repeat RNA] 6

CRISPR/Cas in E. coli Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats 7

CRISPR/Cas in E. coli RNA-transcript van repeat vormt ‘hairpins’. 8

CRISPR/Cas in E. coli REPEAT RNA VOUWEN (stap 1) Maak je eigen repeat RNA (oranje). Zoek de complementaire basen, vouw de hairpin en plak vast. 9

CRISPR/Cas in E. coli Stap 1 (uit het plaatje) gaan we niet uitbeelden. 10

CRISPR/Cas in E. coli Cas9 knipt als… het spacer RNA (20nt) bindt aan een complementaire DNA-streng, én als de andere streng net daarnaast een protospacer adjacent motif (PAM) heeft: ‘5-NGG-’3 SPACER RNA BINDEN AAN DNA (stap 2) Zoek in het virus-DNA (zwart) naar het stuk DNA dat complementair is aan je spacer RNA (groen). Controleer of op de andere streng inderdaad een PAM ligt. 11

CRISPR/Cas in E. coli Eindresultaat: tableax vivant. 12

CRISPR/Cas in E. coli Cas9 UITBEELDEN (stap 3) Beeld uit hoe Cas9 aan het virus-DNA bindt en dat knipt. Het Cas9-enzym heeft vier ‘domeinen’ met elk een specifieke functie: vier personen vormen dus één Cas9-enzym. Maak een foto waarop de vier domeinen goed te zien zijn. Stuur deze naar c.l.geraedts@vu.nl of 06-40294522. 13

CRISPR/Cas in E. coli Eindresultaat: tableax vivant. 14

genome editing met CRISPR/Cas Zelf gRNA synthetiseren om in gen hemoglobine te knippen. 15

genome editing met CRISPR/Cas SPACERS ONTWERPEN (gRNA) Ontwerp nu twee ‘spacers’ (van 20 nt) zodat Cas9 aan weerszijden van de puntmutatie in het hemoglobine-gen kan knippen. Zoek eerst de PAM’s (omcirkel). Bedenk waar RuvC en HNH knippen (zet een streepje). Kies een combinatie van twee knipplekken. Markeer tot slot de basenvolgorde van de twee bijbehorende ‘spacers’ (van 20 nt). Zelf gRNA synthetiseren om in gen hemoglobin te knippen. 16

genome editing met CRISPR/Cas hemoglobine S (sikkelcelanemie)   3’- GGTGTCCCGT CATTGCCGTC TGAAGAGGTG TCCTCAGTCT ACGTGGTACC ACAGACAAAG -5’ 5’- CCACAGGGCA GTAACGGCAG ACTTCTCCAC AGGAGTCAGA TGCACCATGG TGTCTGTTTG –3’ Zelf gRNA synthetiseren om in gen hemoglobin te knippen. 17

genome editing met CRISPR/Cas hemoglobine S (sikkelcelanemie)   3’- GGTGTCCCGT CATTGCCGTC TGAAGAGGTG TCCTCAGTCT ACGTGGTACC ACAGACAAAG -5’ 5’- CCACAGGGCA GTAACGGCAG ACTTCTCCAC AGGAGTCAGA TGCACCATGG TGTCTGTTTG –3’ Zelf gRNA synthetiseren om in gen hemoglobin te knippen. 18

genome editing met CRISPR/Cas hemoglobine S (sikkelcelanemie)   3’- GGTGTCCCGT CATTGCCGTC TGAAGAGGTG TCCTCAGTCT ACGTGGTACC ACAGACAAAG -5’ 5’- CCACAGGGCA GTAACGGCAG ACTTCTCCAC AGGAGTCAGA TGCACCATGG TGTCTGTTTG –3’ Zelf gRNA synthetiseren om in gen hemoglobin te knippen. 19

genome editing met CRISPR/Cas hemoglobine S (sikkelcelanemie)   3’- GGTGTCCCGT CATTGCCGTC TGAAGAGGTG TCCTCAGTCT ACGTGGTACC ACAGACAAAG -5’ 5’- CCACAGGGCA GTAACGGCAG ACTTCTCCAC AGGAGTCAGA TGCACCATGG TGTCTGTTTG –3’ 3’- GGTGUCCCGU CAUUGCCGUC UGA -5’ 3’- GGUG UCCUCAGUCU ACGUGGUAC -5’ 5’- GUAACGGCAG ACUUCUCCAC AGG –3’ 5’- CAC AGGAGUCAGA UGCACCATGG –3’ Zelf gRNA synthetiseren om in gen hemoglobin te knippen. 20

genome editing met CRISPR/Cas 21

gene drive met CRISPR/Cas 22

gene drive met CRISPR/Cas 23

PRAKTISCH stempelset DNA bestellen? www.itsacademy.nl/stempelset-dna/ of nu hier beneden op de markt Lego kopen? www.bouwsteenwinkel.nl meer informatie over uitbeeldpractica? c.l.geraedts@vu.nl en bekijk online het materiaal van eerdere workshops op de voorgaande NIBI-conferenties. 24